Optimierung des Probenvorbereitungsprozesses für die Transmissionselektronenmikroskopie von neuromuskulären Verbindungen in Drosophila-Larven
Summary
Dieser Bericht stellt ein neues Probenvorbereitungsverfahren zur Visualisierung neuromuskulärer Verbindungen in Drosophila-Larven dar. Diese Methode ist im Vergleich zur herkömmlichen Methode wirksamer bei der Verhinderung des Einrollens der Proben und eignet sich besonders für die Ultrastrukturanalyse der neuromuskulären Verbindung von Drosophila .
Abstract
Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) von Drosophila hat sich zu einem wertvollen Modellsystem im Bereich der Neurowissenschaften entwickelt. Die Anwendung der konfokalen Mikroskopie am Drosophila NMJ ermöglicht es den Forschern, synaptische Informationen zu gewinnen, die sowohl quantitative Daten zur Synapsenhäufigkeit als auch detaillierte Einblicke in ihre Morphologie umfassen. Die diffuse Verteilung und der begrenzte visuelle Bereich des TEM stellen jedoch Herausforderungen für die Ultrastrukturanalyse dar. In dieser Studie wird eine innovative und effiziente Probenvorbereitungsmethode vorgestellt, die den herkömmlichen Ansatz übertrifft. Das Verfahren beginnt mit dem Platzieren eines Metallnetzes am Boden einer Flasche oder eines Reagenzglases mit flachem Boden und dem Positionieren der Larvenproben auf dem Netz. Ein zusätzliches Netz wird über die Proben gelegt, um sicherzustellen, dass sie zwischen den beiden Netzen positioniert sind. Die fixierten Proben werden gründlich dehydriert und infiltriert, bevor mit dem Einbettungsverfahren fortgefahren wird. Dann erfolgt die Einbettung der Proben in Epoxidharz in einer flachen Blattweise, die die Vorbereitung der Muskeln für die Positionierung und Schnitte ermöglicht. Mit diesen Schritten können alle Muskeln der Drosophila-Larven lichtmikroskopisch sichtbar gemacht werden, was die spätere Positionierung und Schnittbestimmung erleichtert. Überschüssiges Harz wird nach dem Lokalisieren des 6. und 7. Muskels der Körpersegmente A2 und A3 entfernt. Es wird eine serielle ultradünne Schnittung des 6. oder 7. Muskels durchgeführt.
Introduction
Die Elektronenmikroskopie ist eine der idealsten Methoden zur Untersuchung der Ultrastruktur biologischer Materialien, mit der die innere Struktur von Zellen auf der Nanoskala auf der Nanoskala1 visuell und genau demonstriert werden kann. Aufgrund der Komplexität des Probenvorbereitungsprozesses und der hohen Kosten ist die Elektronenmikroskopie jedoch nicht so beliebt wie die Lichtmikroskopie. Jüngste Fortschritte in der Elektronenmikroskopie haben zu einer deutlichen Verbesserung der Bildqualität geführt, die mit einer bemerkenswerten Reduzierung der damit verbundenen Arbeitsbelastung einhergeht. Daher hat die Elektronenmikroskopie eine wichtige Rolle bei der Weiterentwicklung wissenschaftlicher Erkenntnisse in verschiedenen Bereichen übernommen2.
Drosophila ist ein hervorragendes Tiermodell für die Durchführung genetischer Manipulationen, um die räumliche und zeitliche Expression von Zielgenen präzise zu kontrollieren3. Außerdem hat Drosophila die Vorteile einer kurzen Wachstumsphase und einer einfachen Aufzucht im Vergleich zu Säugetiermodellen; Daher wird Drosophila in der Morphologieforschung häufig verwendet 4,5.
Bei Drosophila-Larven sind die Boutons der neuromuskulären Verbindung (NMJ) in den Muskeln weit verbreitet 6,7, und die Immunfärbung von NMJ kann leicht Aufschluss über die Synapsenmenge und -morphologie geben 8,9 . Die NMJ-Boutons im 6./7. Muskel der Segmente A2 und A3 eignen sich gut für quantitative und morphologische Untersuchungen mittels Lichtmikroskopie. Dies liegt an ihrer Größe und Häufigkeit 10,11. Daher gelten Drosophila-Larven NMJs als nützliches Modell für die neurowissenschaftliche Forschung12.
Es ist jedoch schwierig, die NMJ-Bouton-Ultrastruktur mit dem TEM zu beobachten. Da das Scanfenster der Transmissionselektronenmikroskopie schmal ist, ist es schwierig, die weit verteilten NMJ-Boutons13 zu positionieren. Der andere Grund ist, dass die Körperwand von Drosophila während des Alkoholdehydratisierungsschritts des Probenvorbereitungsprotokolls7 anfällig für Kräuseln ist.
In traditionellen Studien wurden in der Regel Boutons zwischen dem 6. und 7. Muskel des A2– und A3-Segments als Probenmaterial ausgewählt, da sie häufig vorkommen und eine Größevon 14,15 haben. Der 6. und 7. Muskel des Segments A2 undA 3 sind größer als die anderen Muskeln und enthalten mehr Boutons. Bei der Vorbereitung der Proben für die Elektronenmikroskopie neigten die fixierten Proben jedoch dazu, dünn zu werden und sich zu kräuseln, was zu einer Fehlpositionierung des 6. und 7. Muskels desA2– undA3-Segments führte.
Wir berichten hiermit über ein neues Verarbeitungsverfahren, das das Kräuseln der Proben im Vergleich zur traditionellen Methode der Probenvorbereitung 7,16 wirksamer verhindert, indem es die Proben während der anschließenden Dehydratisierung flach bleiben lässt, wodurch eine bessere Positionierung der neuromuskulären Verbindungen der Drosophila-Larven ermöglicht wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila-Larvenproben neigen dazu, sich während der Dehydrierung zusammenzurollen, da die Proben dünn sind, was es schwierig macht, den neuromuskulären Übergang genau zu lokalisieren, wodurch die Schwierigkeit und der Arbeitsaufwand für die Probenvorbereitung erhöht werden. Die traditionelle Verbesserung besteht darin, die Probe7 zu kürzen, aber die Proben waren immer noch unterschiedlich stark gewellt.
Bei unserer Methode gibt es zwei kritische Schrit…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of China Grant 32070811 und dem Analysis Test Fund 11240090971 der Southeast University (China) unterstützt. Wir danken dem Labor für Elektronenmikroskopie und dem Zentrum für morphologische Analyse, School of Medicine, Southeast University, Nanjing, China.
Materials
| 1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
| Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
| Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
| K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
| K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
| Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
| SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
| Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
| Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
| Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |
References
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