Huellas dactilares cardiolipina en leucocitos por espectrometría de masas para un diagnóstico rápido del síndrome de Barth

El síndrome de Barth (BTHS) es una enfermedad rara ligada al cromosoma X caracterizada por miocardiopatía de inicio temprano, miopatía del músculo esquelético, retraso en el crecimiento, neutropenia, disfunción variable de la cadena respiratoria mitocondrial y estructura mitocondrial anormal 1,2,3,4,5. BTHS tiene una prevalencia de un caso por millón de hombres con actualmente menos de 250 casos conocidos en todo el mundo, aunque es ampliamente aceptado que la enfermedad está infradiagnosticada ^2,6. BTHS resulta de mutaciones de pérdida de función del gen Tafazzin (TAFAZZIN) localizado en el cromosoma Xq28.12 ^7,8 que causan una remodelación deficiente del fosfolípido mitocondrial cardiolipina (CL), un proceso que normalmente conduce a una composición de acilo altamente simétrica e insaturada ^9,10. Cl ha sido considerado el lípido característico de las mitocondrias, donde es un componente importante de la membrana interna, vital para la fosforilación oxidativa (es decir, el metabolismo energético mitocondrial), la formación de supercomplejos, la importación de proteínas y está involucrado en la dinámica mitocondrial, la mitofagia y la apoptosis ^{11,12,13,14,15,16} . Tras la pérdida de la función de TAFAZZIN, la remodelación de CL falla y surgen anomalías específicas de fosfolípidos en las mitocondrias de pacientes con BTHS: el nivel maduro de CL (CLm) disminuye, mientras que se produce un aumento de los niveles de monolisocardiolipina (MLCL) y una composición alterada de CL acilo (es decir, especies de CL inmaduras, CLi). Esto lleva a un aumento dramático de la relación MLCL/CL¹⁷.

El diagnóstico de BTHS es a menudo difícil, ya que el trastorno presenta características clínicas y bioquímicas extremadamente variables y puede diferir entre los individuos afectados de la misma familia y dentro de un paciente a lo largo del tiempo ^3,5. Muchos niños BTHS muestran un nivel muy alto de excreción urinaria de ácido 3-metilglutacónico (3-MGCA), pero el nivel de orina puede ser normal o solo un aumento leve en pacientes con el tiempo³. Sin embargo, el aumento de 3-MGCA es una característica de varios otros trastornos mitocondriales y no mitocondriales, como la deficiencia de 3-metilglutaconil-CoA hidratasa (defecto AUH), aciduria 3-metilglutacónica, distonía-sordera, encefalopatía, síndrome de Leigh (MEGDEL), síndrome de Costeff y miocardiopatía dilatada con ataxia (DCMA)^18,19 . Por lo tanto, la escasa especificidad del 3-MCGA como marcador de BTHS y la enorme variabilidad en los pacientes hacen que el diagnóstico bioquímico sea ambiguo.

Además, se han descrito más de 120 mutaciones diferentes de TAFAZZIN que causan el trastorno⁵ y, por lo tanto, un diagnóstico genético puede ser complicado, lento y costoso. Además, el análisis molecular del gen TAFAZZIN puede dar lugar a resultados falsos negativos en presencia de mutaciones en secuencias no codificantes o reguladoras³. BTHS puede ser probado inequívocamente determinando las cantidades relativas y la distribución de las especies (monolyso-)CL y confirmado por secuenciación del gen TAFAZZIN o viceversa.

Una prueba práctica para el diagnóstico es la medición de la relación MLCL/CL mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y análisis de ionización por electropulsión / espectrometría de masas (ESI/MS) en el punto sanguíneo^20,21. La medición del nivel de CL por sí sola no es adecuada para el diagnóstico, ya que algunos pacientes tienen niveles casi normales de CL pero alteran la relación MLCL/CL. Por lo tanto, la medición de la relación MLCL/CL tiene una sensibilidad y especificidad del 100% para el diagnóstico de BTHS²¹. Se ha establecido otro método validado basado en el análisis de HPLC y ESI/MS sobre leucocitos²², pero las complejas técnicas cromatográficas para la separación de lípidos previamente extraídos y la cara de los instrumentos restringen este análisis a unos pocos laboratorios clínicos. Todos estos factores, junto con la falta de una prueba diagnóstica directa, han contribuido al infradiagnóstico de la afección.

MALDI-TOF/MS es otra herramienta válida en el análisis de lípidos^23,24. Esta técnica analítica se puede utilizar para obtener directamente perfiles lipídicos de diversas muestras biológicas, saltándose así los pasos de extracción y separación 25,26,27,28,29, incluso en secciones de tejido para aplicaciones de MS Imaging ³⁰. Dada esta ventaja, se desarrolló un método simple y rápido para diagnosticar BTHS mediante el perfil de CL mitocondrial en leucocitos intactos con MALDI-TOF/MS²⁸. El aislamiento leucocitario de solo 1 ml de sangre total por sedimentación y lisis de eritrocitos es sencillo y no requiere equipos o reactivos especiales. Además, se describió un protocolo rápido de “miniextracción” de lípidos aplicable a cantidades diminutas de leucocitos para garantizar la adquisición exitosa de espectros que tienen señales MS más limpias con una relación señal-ruido (S / N) más alta que en las obtenidas de leucocitos intactos²⁸. Este paso adicional lleva poco tiempo y permite que los análisis sean reproducibles incluso cuando se llevan a cabo en instrumentos de EM con poca sensibilidad. En resumen, el método analítico descrito aquí requiere una preparación mínima de la muestra porque se puede omitir la separación cromatográfica de lípidos que consume mucho tiempo y mano de obra, lo que acelera la prueba.