Summary

חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

Published: March 06, 2021
doi:

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להתאים את שיטת הבהירות של רקמות המוח עבור רטינות הר שלם כדי לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים ברשתית ואת המבנים התת תאיים שלהם.

Abstract

שיטת ההזיה הידרוג’ל רקמה (CLARITY), שפותחה במקור על ידי מעבדת Deisseroth, שונתה בשימוש נרחב עבור immunostaining והדמיה של דגימות מוח עבות. עם זאת, טכנולוגיה מתקדמת זו עדיין לא שימשה עבור רטינות הר שלם. למרות הרשתית היא שקופה חלקית, עובי של כ 200 מיקרומטר (בעכברים) עדיין מגביל את החדירה של נוגדנים לתוך הרקמה העמוקה, כמו גם הפחתת חדירת אור להדמיה ברזולוציה גבוהה. כאן, התאמנו את שיטת הבהירות עבור רשתית עכבר הר שלם על ידי פילמור אותם עם מונומר אקרילאמיד כדי ליצור הידרוג’ל nanoporous ולאחר מכן לנקות אותם נתרן דודקיל סולפט כדי למזער את אובדן החלבון ולמנוע נזק לרקמות. רשתיות מעובדות בהירות היו immunostained עם נוגדנים עבור נוירונים ברשתית, תאי גליה, וחלבונים סינפטיים, רכוב בתמיסת התאמת אינדקס שבירה, ודימוי. הנתונים שלנו מראים כי CLARITY יכול לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים והדמיה עבור נוירונים ברשתית ותאי גליה בהכנה לכל ההר. לדוגמה, רזולוציה תלת-ממדית של מבנים דקים דמויי אקסון ודנדריטי של תאי אמקרין דופאמין השתפרה בהרבה על ידי CLARITY. בהשוואה לרטינות לא מעובדות של הרכבה שלמה, CLARITY יכולה לחשוף חיסונים לחלבונים סינפטיים כגון חלבון בצפיפות פוסט-סינפטית 95. התוצאות שלנו מראות כי CLARITY הופך את הרשתית לשקופה יותר מבחינה אופטית לאחר הסרת השומנים ומשמר מבנים עדינים של נוירונים ברשתית וחלבונים שלהם, אשר ניתן להשתמש בהם באופן שגרתי להשגת הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים ברשתית ומבנים תת-תאיים שלהם בהכנה לכל ההר.

Introduction

הרשתית החולייתנית היא אולי החלק הנגיש ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS), והיא משמשת מודל מצוין לחקר ההתפתחות, המבנה והתפקוד של המוח. חמישה סוגים של נוירונים ברשתית מופצים בשלוש שכבות גרעיניות המופרדות על ידי שתי שכבות plexiform. השכבה הגרעינית החיצונית (ONL) מורכבת מצלמי פוטורצפטורים קלאסיים (מוטות וקונוסים) הממירים אור לאותות חשמליים. אותות חשמליים מעובדים על ידי נוירונים בשכבה הגרעינית הפנימית (INL), כולל תאים דו קוטביים, אופקיים ואמקרין, ולאחר מכן מועברים לתאי גנגליון ברשתית (RGCs) בשכבת תא הגנגליון (GCL). RGCs הם נוירוני הפלט של הרשתית, כאשר האקסונים מקרינים למוח לתרום לתפקוד חזותי יוצר תמונה ולא יוצר תמונה. בנוסף, שלושה סוגים של תאי גליה (תאי מולר, אסטרגליה ומיקרוגליה) מספקים חומרים מזינים לנוירונים ומגנים על נוירונים מפני שינויים מזיקים בסביבה החוץ-תאית שלהם.

תת-אוכלוסין מיוחד אחד של תאי אמקרין מייצר ומשחרר דופמין, נוירומודולטור חשוב במערכת העצבים המרכזית, מגדיר מחדש מעגלים עצביים ברשתית במהלך הסתגלות אור1,2. לתאי אמקרין דופאמין (DACs) יש תכונה ייחודית של פרופילים מורפולוגיים. הסומטה שלהם ממוקמים INL proximal עם דנדריטים ramifying בחלק הדיסטלי ביותר של שכבת plexiform הפנימית (IPL). תהליכים דמויי אקסון של DACs הם unmyelinated, רזה וארוך, מסועף בדלילות, לשאת varicosities (האתרים של שחרור דופמין). הם יוצרים מקלעת צפופה עם דנדריטים ב- IPL, כולל מבנים דמויי טבעת סביב הסומטה של תאי אמקרין AII. האקסונים גם לרוץ דרך INL לכיוון OPL, יצירת מסלול צנטריפוגלי על פני הרשתית3. הוכחנו כי תהליכי DAC מבטאים קולטנים בתגובה לשחרור גלוטמט מתאי עצב פרה-קוטביים, כולל תאים דו קוטביים ותאי גנגליון רשתית רגישים באופן מהותי (ipRGCs)4,5,6. עם זאת, לא ברור אם קולטני גלוטמט מבטאים על האקסונים, הדנדריטים, או שניהם מכיוון שהם מנותקים בקטעי רשתית אנכיים ולא ניתן להבחין ביניהם5,6. חיסון צריך להתבצע ברשתיות הר שלם כדי לחשוף הסתעפות תלת מימדית של DACs ואת נוכחותם של קולטני גלוטמט על תאים תת תאיים. למרות הרשתית היא שקופה יחסית, עובי של רשתית הר עכבר כולו הוא כ 200 מיקרומטר, אשר מגביל את החדירה של נוגדנים לתוך הרקמה העמוקה, כמו גם מפחית חדירת אור להדמיה ברזולוציה גבוהה עקב פיזור אור רקמה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, התאמנו את שיטת ההידרוגל התואמת לרקמות (CLARITY) שפותחה לאחרונה עבור מקטעי מוח עבים לרטינות עכבר הר שלם7.

שיטת CLARITY פותחה במקור על ידי מעבדת Deisseroth עבור immunostaining והדמיה של דגימות מוחעבות 7. הוא משתמש בחומר ניקוי חזק, נתרן דודציל סולפט (SDS) ואלקטרופרזה כדי להסיר את רכיבי השומנים (הגורמים לפיזור אור רקמות), ומשאיר את החלבונים וחומצות הגרעין במקומם. השומנים שהוסרו מוחלפים בפיגום שקוף המורכב ממונומרים הידרוג’ל כגון אקרילאמיד לתמיכה במבנה החלבון הנותר. ניתן לתייג את הרקמה המנוקה באמצעות אימונוהיסטוכימיה ולצלם אותה עם עומק חדירת אור מוגבר באופן משמעותי דרך הרקמה (עד כמה מילימטרים מתחת לפני השטח של הרקמה). מאז, שיטת CLARITY עברה אופטימיזציה ופישוט על ידי מספר קבוצות מחקר8,9,10. פרוטוקול CLARITY שונה משתמש בטכניקת סליקה פסיבית כדי למנוע את הנזק האפשרי לרקמות המיוצר על ידי אלקטרופורזה לניקוי המוח כולו ואיברים שלמים אחרים11. עם זאת, שיטה זו עדיין לא הוחלה על רשתית הר שלם. כאן, התאמנו את טכניקת הבהירות הפסיבית עבור רטינות הר שלם כדי להפוך אותם שקופים יותר עבור אימונוהיסטוכימיה והדמיה. מצאנו כי רוב החלבונים ברשתית שנבדקו נשמרו במהלך תהליך זה עבור אימונוהיסטוכימיה. באמצעות פתרון התאמת אינדקס שבירה, הצלחנו לדמיין נוירונים ברשתית על פני עובי של כ 200 מיקרומטר מן ONL ל- GCL ברשתית הרכבה שלמה.

Protocol

טיפול בעכבר וכל ההליכים הניסיוניים נערכו על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות עבור חיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת אוקלנד (פרוטוקול מס ‘ 18071). הערה: שמות הפתרונות והיצירות שלהם מפורטים בטבלה 1. 1. הכנת רק?…

Representative Results

רשתית מעובדת בהירות שונה הם רקמה שקופה אופטית.כדי לגבש שיטת ניקוי רקמות התואמת ליישומים אימונוהיסטוכימיים ברשתית תוך מתן לשון נאותה ושימור השלמות המבנית של החלבונים התאיים, התאמנו את שיטת ניקוי רקמת CLARITY לרשתיות עכברים שלמות. הצלחנו לפשט את הפרוטוקול ולשנות אותו עבור רשתית הר…

Discussion

שינוי פרוטוקול CLARITY עבור רשתית הרכבה שלמה.
פישטנו את פרוטוקול CLARITY כדי להשיג פולמור הולם ללא צורך בפינוי ואקום או תא ייבוש, כפי שנעשה ברוב המחקריםהקודמים 7,9,11. תהליך הפולמליזציה מעוכב על ידי חמצן, הדורש כי המדגם להיות מבודד מהאוו…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לבינג יה, ניית’ן ספיקס והאו ליו על התמיכה הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למענקי בריאות EY022640 (D.-Q.Z.) ופרס מחקר הסטודנטים של אוניברסיטת אוקלנד (E.J.A.).

Materials

16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Fixative
Acrylamide Fisher Biotech BP170 Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2 Zeiss Fluorscence microscope
BSA Fisher Scientific BP1600 Blocking agent
Eclipse Ti Nikon Instruments Scanning confocal microscope
KCl VWR BDH0258 Buffer component
KH2PO4 Sigma P5655 Buffer component
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763 Buffer component
NaCl Sigma Aldrich S7653 Buffer component
NaH2PO4 Sigma Aldrich S0751 Buffer component
NaN3 Sigma Aldrich S2002 Bacteriostatic preservative
NDS Aurion 900.122 Blocking agent
NIS Elements AR Nikon Image analysis software
SDS BioRad 1610301 Delipidation agent
Sorbitol Sigma Aldrich 51876 Buffer component
Triton-X-100 Sigma T8787 Surfactant
Tween-20 Fisher Scientific BP337 Surfactant
VA-044 Wako Chemicals 011-19365 Thermal initiator

References

  1. Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
  2. McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
  3. Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
  4. Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
  5. Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
  6. Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
  7. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
  8. Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
  9. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  10. Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
  11. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  12. Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
  13. Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).

Play Video

Citer Cet Article
Alessio, E. J., Zhang, D. Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method. J. Vis. Exp. (169), e62178, doi:10.3791/62178 (2021).

View Video