Иммуноокрашивание цельно-маунтных сетчаток с помощью метода очистки тканей CLARITY

Сетчатка позвоночных является, пожалуй, наиболее доступной частью центральной нервной системы (ЦНС), и она служит отличной моделью для изучения развития, структуры и функции мозга. Пять классов нейронов в сетчатке распределены в трех ядерных слоях, разделенных двумя плексиформными слоями. Внешний ядерный слой (ONL) состоит из классических фоторецепторов (стержней и колбочка), которые преобразуют свет в электрические сигналы. Электрические сигналы обрабатываются нейронами во внутреннем ядерном слое (INL), включая биполярные, горизонтальные и амакриновые клетки, а затем передаются в ганглиоцитные клетки сетчатки (RGCs) в ганглиевом клеточном слое (GCL). RGC являются выходными нейронами сетчатки, при этом аксоны проецируются на мозг, чтобы способствовать формированию изображения и не-образующей визуальные функции. Кроме того, три типа глиальных клеток (клетки Мюллера, астроглия и микроглия) обеспечивают нейроны питательными веществами и защищают нейроны от вредных изменений в их внеклеточной среде.

Одна специализированная субпопуляция амакриновых клеток продуцирует и высвобождает дофамин, важный нейромодулятор в ЦНС, реконфигурируемый нейронные цепи сетчатки во время световой адаптации^1,2. Дофаминергические амакриновые клетки (ЦАП) обладают уникальной особенностью морфологических профилей. Их соматы расположены в проксимальном INL с дендритами, разветвляющимися в самой дистальной части внутреннего плексиформного слоя (IPL). Аксоноподобные процессы ЦАП немиелиновые, тонкие и длинные, редко разветвленные и несут варикозное расширение вен (места высвобождения дофамина). Они образуют плотное сплетение с дендритами в IPL, включая кольцеподобные структуры вокруг соматов амакриновых клеток AII. Аксоны также проходят через INL к OPL, образуя центробежный путь через сетчатку^3. Мы продемонстрировали, что процессы DAC экспрессируют рецепторы в ответ на высвобождение глутамата из пресинаптических нейронов, включая биполярные клетки и внутренне светочувствительные ганглиозные клетки сетчатки (ipRGCs)^4,5,6. Однако неясно, экспрессируются ли глутаматные рецепторы на аксонах, дендритах или на обоих, поскольку они отрезаны в вертикальных срезах сетчатки и не могут быть отличимы друг от друга^5,6. Иммуноокрашивание необходимо проводить в цельномонтных сетчатках, чтобы выявить трехмерное разветвление ЦАП и наличие глутаматных рецепторов на субклеточных компартментах. Хотя сетчатка относительно прозрачна, толщина сетчатки с целым креплением мыши составляет примерно 200 мкм, что ограничивает проникновение антител в глубокие ткани, а также уменьшает проникновение света для визуализации с высоким разрешением из-за рассеяния света в тканях. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы адаптировали иммуноокрашающий совместимый метод делипидации тканевых гидрогелей (CLARITY), разработанный недавно для толстых участков мозга, к цельной сетчатке мыши^7.

Метод CLARITY был первоначально разработан лабораторией Дейссерота для иммуноокрашения и визуализации толстых образцов мозга^7. Он использует сильное моющее средство, додецилсульфат натрия (SDS) и электрофорез для удаления липидных компонентов (которые вызывают рассеяние света в тканях), оставляя белки и нуклеиновые кислоты на месте. Удаленные липиды заменяются прозрачным каркасом, состоящим из гидрогелевых мономеров, таких как акриламид, для поддержки оставшейся белковой структуры. Очищенная ткань может быть помечена с помощью иммуногистохимии и визуалирована с существенно увеличенной глубиной проникновения света через ткань (до нескольких миллиметров ниже поверхности ткани). С тех пор метод CLARITY был оптимизирован и упрощен несколькими исследовательскими группами^8,9,10. Модифицированный протокол CLARITY использует пассивную технику очистки, чтобы избежать возможного повреждения тканей, вызванного электрофорезом для очистки всего мозга и других неповрежденных органов^11. Однако этот метод еще не применялся к цельномонтным сетчаткам. Здесь мы адаптировали пассивную технику CLARITY для цельномонтных сетчаток, чтобы сделать их более прозрачными для иммуногистохимии и визуализации. Мы обнаружили, что большинство протестированных белков сетчатки были сохранены во время этого процесса иммуногистохимии. Используя решение для сопоставления показателей преломления, мы смогли получить изображение нейронов сетчатки толщиной около 200 мкм от ONL до GCL в цельных сетчатках.