使用清晰组织清除方法对全山视网膜进行免疫染色
Summary
在这里，我们提出了一个协议，以调整整个安装视网膜脑组织的CLARITY方法，以提高标准免疫化学染色和视网膜神经元及其细胞下结构的高分辨率成像的质量。
Abstract
组织水凝胶脱皮法（CLARITY），最初由戴塞罗斯实验室开发，已被修改并广泛用于免疫染色和成像厚脑样本。然而，这种先进的技术尚未用于全山视网膜。虽然视网膜是部分透明的，但其厚度约为200微米（小鼠），仍然限制抗体渗透到深层组织，并降低高分辨率成像的光渗透。在这里，我们采用了CLARITY方法，用丙烯酰胺单体聚合，形成纳米多孔水凝胶，然后用硫酸钠清除它们，以尽量减少蛋白质损失，避免组织损伤。CLARITY处理的视网膜被视网膜神经元、胶质细胞和突触蛋白的抗体所感染，安装在折射指数匹配溶液中，并成像。我们的数据表明，CLARITY可以提高全安装制备中视网膜神经元和胶质细胞的标准免疫化学染色和成像的质量。例如，CLARITY 大大提高了多巴胺胺类阿米林细胞精细轴突状和树突状结构的 3D 分辨率。与非加工全山视网膜相比，CLARITY 可以揭示突触蛋白（如后突触密度蛋白 95）的免疫染色。我们的结果表明，在去除脂质后，CLARITY 使视网膜更加透明，并保留了视网膜神经元及其蛋白质的精细结构，这些结构可用于在全安装制备中获取视网膜神经元及其子细胞结构的高分辨率成像。
Introduction
脊椎动物直膜也许是中枢神经系统（CNS）中最容易接近的部分，是研究大脑发育、结构和功能的极好模型。网状膜中的五类神经元分布在三个核层中，由两个丛状层隔开。外核层（ONL）由将光转换成电信号的经典光感受器（棒和圆锥体）组成。电信号由内核层 （INL） 中的神经元处理，包括双极、水平和阿马林细胞，然后传输到结节细胞层 （GCL） 中的视网膜结节细胞 （RGCs）。RGC 是视网膜的输出神经元，轴突投射到大脑中，有助于图像形成和非图像形成的视觉功能。此外，三种类型的胶质细胞（穆勒细胞、天文胶质和微胶质）为神经元提供营养，并保护神经元免受细胞外环境的有害变化。
一种特殊的亚种群的阿马克莱细胞产生和释放多巴胺，在CNS中的重要神经调节器，重新配置视网膜神经回路在光适应1，2。多巴胺胺性腺素细胞 （DACs） 具有形态特征的独特特征。他们的索玛塔位于近侧的 INL 中，树突在内丛状层 （IPL） 的最荒凉部分进行撞击。DAC 的Axon 样过程是未细化、薄而长、枝条稀疏且具有差异（多巴胺释放的部位）。它们与 IPL 中的树突形成密集的丛状物，包括围绕 AII amacrine 细胞的索马塔周围的环状结构。轴突也穿过 INL 向 OPL 运行，形成一条穿过视网膜3的离心通道。我们已经证明，DAC处理表达受体，以回应谷氨酸释放从前突性神经元，包括双极细胞和内在感光视网膜结节细胞（ipRGCs）4，5，6。然而，目前还不清楚谷氨酸受体是否表达在轴突上，树突上，或两者，因为它们被切断在垂直视网膜部分，不能区分彼此5，6。需要在整个安装视网膜中进行免疫染色，以揭示 DAC 的三维分支和亚细胞隔间中谷氨酸受体的存在。虽然视网膜相对透明，但小鼠全坐骑视网膜的厚度约为 200 μm，这限制了抗体渗透到深层组织，并减少了组织光散射导致的高分辨率成像光渗透。为了克服这些限制，我们调整了免疫染色相容组织水凝胶脱脂方法（CLARITY）最近开发的厚脑部分到全安装小鼠视网膜7。
CLARITY方法最初是由戴塞罗斯实验室开发的，用于免疫和成像厚脑样本7。它使用强洗涤剂、硫酸钠 （SDS） 和电磷酸盐去除脂质成分（导致组织光散射），使蛋白质和核酸就位。去除的脂质被一个透明的脚手架所取代，该脚手架由丙烯酰胺等水凝胶单体组成，以支持剩余的蛋白质结构。清除的组织可以通过免疫化学进行标记，并通过组织（组织表面以下几毫米）显著增加光渗透深度进行成像。此后，由8、9、10几个研究小组对CLARITY方法进行了优化和简化。修改后的CLARITY协议使用被动清除技术，以避免电泳可能产生的组织损伤，用于清除全脑和其他完整的器官11。然而，这种方法尚未应用于全山视网膜。在这里，我们为全山视网膜采用了被动的CLARITY技术，使其在免疫化学和成像方面更加透明。我们发现，在免疫造血过程中，大多数被测试的视网膜蛋白都保存下来。使用折射指数匹配解决方案，我们能够在全山视网膜中从 ONL 到 GCL 的大约 200μm 厚度上对视网膜神经元进行成像。
Protocol
Representative Results
Discussion
修改全安装视网膜的清晰协议。
我们已经简化了CLARITY协议，以实现足够的聚合，而无需真空疏散或干燥室，如大多数以前的研究7，9，11所使用。聚合过程受到氧气的抑制，要求样品在协议的聚合步骤中从空气中分离。然而，我们发现，用油覆盖样品，而不是用氮气去气，从而充分隔离样品，使聚合在彻底冲洗?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢叶冰冰、内森·斯皮克斯和刘浩的技术支持。这项工作得到了国家健康补助金研究所EY022640（D.-Q.Z.）和奥克兰大学教务长本科生研究奖（E.J.A.）的支持。
Materials
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
