Summary

Plazma Lipoproteinlerinin Ultracentrifugation ile İzolasyonu ve Analizi

Published: January 28, 2021
doi:

Summary

Plazma lipoproteinlerinin analizi için çeşitli yöntemler kullanılmıştır; ancak, ultrasantrifüjleme hala en popüler ve güvenilir yöntemlerden biridir. Burada, sıralı yoğunluklu ultrasantrifüjasyon kullanarak lipoproteinlerin plazmadan nasıl izole edilmesi ve apolipoproteinlerin hem tanı hem de araştırma amacıyla nasıl analiz edilmesi ile ilgili bir yöntem açıklıyoruz.

Abstract

Plazma lipoproteinlerinin ve apolipoproteinlerin analizi dislipidemi tanısı ve lipid metabolizması ve ateroskleroz çalışmaları için önemli bir parçadır. Plazma lipoproteinlerini analiz etmek için çeşitli yöntemler olmasına rağmen, ultrasantrifüjleme hala en popüler ve güvenilir yöntemlerden biridir. Bozulmamış ayırma prosedürü nedeniyle, bu yöntemle izole edilen lipoprotein fraksiyonları, lipoproteinlerin, apolipoproteinlerin, proteomların analizi ve kültürlü hücreler in vitro ile lipoproteinlerin fonksiyonel çalışması için kullanılabilir. Burada, VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDL'ler (d=1.04 ve 1.06 g/mL), HDL'ler (d=1.08, 1.10 ve 1.21 g/mL) sıralı yüzer ultrasantrifüj kullanarak tavşan plazmasından. Buna ek olarak, okuyuculara SDS-PAGE ve Western blotting tarafından apoA-I, apoB ve apoE gibi apolipoproteinlerin nasıl analiz edeceğimizi tanıtıyoruz ve hiperlipidemik tavşan modellerini kullanarak lipoprotein ve apolipoprotein profillerinin temsili sonuçlarını gösteriyoruz. Bu yöntem hem klinisyenler hem de temel bilim adamları için lipoprotein fonksiyonlarını analiz etmek için standart bir protokol haline gelebilir.

Introduction

Dislipidemi dünyada aterosklerotik hastalığın başlıca risk faktörüdür. Yüksek düzeyde düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL’ler) ve düşük yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL’ ler) yüksek koroner kalp hastalığı riski (CHD)1,2ile yakından ilişkilidir. Klinik ortamda, hem LDL-kolesterol (LDL-C) hem de HDL-kolesterol (HDL-C) rutin olarak bir klinik laboratuvarda otomatik bir analizör kullanılarak ölçülür3,4. Buna rağmen, dislipidemi tanısı ve insan ve deney hayvanlarında lipid metabolizması ve ateroskleroz çalışması için lipoprotein profillerini ayrıntılı olarak analiz etmek önemlidir. Ultrasantrifüjasyon, boyut dışlama kromatografisi [hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)], agarose ve poliakrilamid jeller tarafından elektroforez, nükleer manyetik rezonans ve seçici kimyasal çökeltme gibi plazma lipoproteinlerini polianyonlar ve divalent katyonlar veya diğer kimyasallar kullanılarak analiz etmek için çeşitli yöntemler bildirilmiştir. 1950’lerde Havel’in grubu ilk olarak ultrasantrifüjleme kullanan yoğunluklar tarafından tanımlanan lipoprotein kavramını önerdi ve bunları chylomicrons (CM), çok düşük yoğunluklu lipoproteinler (VLDL), orta yoğunluklu lipoproteinler (IDL), LDL ve HDL5 ve daha sonra diğer gruplar tarafından daha da değiştirildi6,7. Şimdiye kadar, ultrasantrifüjleme en popüler ve güvenilir yöntemdir, ancak pratik protokol hala mevcut değildir. Bu yazıda, başlangıçta daha önce açıklanan sıralı yoğunluklu yüzer ultrasantrifüjasyon kullanarak küçük bir plazma ölçeğini izole etmek için kullanımı kolay bir protokol tanımlamaya çalıştık8. Yedi plazma lipoprotein fraksiyonunun izolasyonu [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDL'ler (d=1.04 ve 1.06 g/mL), HDL'ler (d=1.08, 1.10 ve 1.21 g/mL)] araştırmacıların hem lipoproteinlerin hem debunlarınbileşimsel apolipoproteinleri 9 , 10,11’inkapsamlı bir analizini yapmasını sağlar. Sağlam yedi ardışık yoğunluklu lipoprotein, lipoprotein fonksiyonlarını analiz etmek ve ayrıca hücre bazlı in vitro stratejilere hizmet etmek için kullanılabilir. Bu protokol hem klinik tanı hem de temel araştırmalar için yararlı olmalıdır. Burada tavşan plazmasını örnek olarak diğer türlerden alınan plazma aynı şekilde uygulanabilirken bu tekniği göstermek için kullandık.

Protocol

Tavşan çalışmaları için tüm prosedürler Yamanashi Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi’nin onayı ile gerçekleştirildi (Onaylı sayı: A28-39). 1. Tavşan kanından plazma ayrımı Kan almak için 15 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0) içeren 1,5 mL mikrotüpler hazırlayın. Bir tavşanı bir kısıtlayıcıya koyun ve 22 kalibrelik bir iğne kullanarak bir asuriküler ara arteri delin ve bir tüpe kan toplayın. Kanı EDTA ile hafifçe karıştırın …

Representative Results

Bu protokolü kullanarak, 1 mL plazma kullanarak tavşan lipoproteinlerini izole ettik ve yedi yoğunluk fraksiyonu elde ettik. İzole yoğunluk fraksiyonları, çoğu araştırma amacıyla yukarıda açıklandığı gibi lipitleri ve apolipoproteinleri ölçmek için yeterlidir. Aynı prosedür, plazma lipoproteinlerini insan ve diğer türlerden izole etmek için de kullanılabilir. Fareler gibi küçük boyutlu hayvanlar için havuzlanmış plazma gereklidir. Şekil 3, normal standart (NS…

Discussion

Hiperlipidemi aterosklerotik hastalığın en önemli risk faktörlerinden biridir. Bu nedenle, plazma lipoproteinlerinin analizi sadece dislipidemi hastalarının tanısı için değil, aynı zamanda lipoprotein metabolizması ve aterosklerozun moleküler mekanizmalarının araştırılması için de önemlidir. Bu çalışmada ultrasantrifüjasyonun mevcut olduğu laboratuvarlarda uygulanabilen plazma lipoproteinlerinin izolasyon ve analiz protokolünü anlattık. Bu yöntemle elde edilen bilgiler kapsamlı ve basittir…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI’nin JP 20K08858, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81941001 ve 81770457), Japonya-Çin Araştırma Kooperatifi Programı kapsamında JSPS-CAS’tan aldığı araştırma hibeleri ile desteklendi.

Materials

22-gauge needle Terumo NN-2232S For blood collection
96-well microplate greiner bio-one 655101 For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibody LifeSpan BioSciences LS-C314186 For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibody ROCKLAND 600-101-111 For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibody Merck Millipore AB947 For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 299-50101 For apolipoprotein analysis
Centrifuge HITACHI himac CF15RN
Closure Spectrum 132736 For lipoprotein dialysis
Dialysis tubing FUJIFILM Wako Pure Chemical 043-30921 For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat block Major Science MD-01N For SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 For Western blotting
Electrophoresis Chamber BIO-RAD Mini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate FUJIFILM Wako Pure Chemical 345-01865 For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paper ADVANTEC 590 For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotor BECKMAN COULTER 357656 TLA-120.2
Fixing solution For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbrane BIO-RAD 1620177 For Western blotting
Lumino image analyzer GE Healthcare For Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrer ADVANTEC SR-304 For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARK BIO-RAD For lipids measurment
Microtube INA-OPTIKA SC-0150
Orbital agitator USBDbo Stovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibody Jackson ImmunoResearch 705-035-003 For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 715-035-150 For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 433-36201 For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge Tubes BECKMAN COULTER 343778
Potassium Bromide FUJIFILM Wako Pure Chemical 168-03475 For density solution
Power Supply BIO-RAD For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra BIO-RAD 161-0377 For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainer Natsume Seisakusho KN-318 For blood collection
Rotor HITACHI T15A43
SDS-PAGE running buffer 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x) 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel 4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powder FUJIFILM Wako Pure Chemical 190-12865 For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 439-17501 For lipids measurment
Triglyicerides assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 432-40201 For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tube BECKMAN COULTER 347960 For lipoprotein isolation
Tween 20 SIGMA-ALDRICH P1379 For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
Ultracentrifuge BECKMAN COULTER A95761 Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer system BIO-RAD Mini Trans-Blot Cell

References

  1. Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
  2. Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
  3. Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
  4. Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
  5. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
  6. Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
  7. Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
  8. Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
  9. Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
  10. Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
  11. Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
  12. Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
  13. Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
  14. Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
  15. Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
  16. von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
  17. Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
  18. Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
  19. De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
  20. Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).

Play Video

Citer Cet Article
Niimi, M., Yan, H., Chen, Y., Wang, Y., Fan, J. Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation. J. Vis. Exp. (167), e61790, doi:10.3791/61790 (2021).

View Video