Summary

극심분리에 의한 혈장 지단백질의 격리 및 분석

Published: January 28, 2021
doi:

Summary

혈장 지단백질을 분석하기 위해 여러 가지 방법이 사용되었습니다. 그러나, 초원심 분리는 여전히 가장 인기 있고 신뢰할 수있는 방법 중 하나입니다. 여기서는 순차밀도 극심분리를 이용하여 플라즈마로부터 지단백질을 분리하는 방법과 진단 및 연구 목적으로 아폴리포단백질을 분석하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.

Abstract

플라즈마 지단백질과 아폴리포단백질의 분석은 지질 대사와 죽상 동맥 경화증의 이상지질혈증 진단 및 연구 결과를 위한 필수적인 부분입니다. 플라즈마 지단백질을 분석하기 위한 몇 가지 방법이 있지만, 초원심 분리는 여전히 가장 인기 있고 신뢰할 수 있는 방법 중 하나입니다. 그것의 그대로 분리 절차 때문에, 이 방법에 의해 고립된 지단백질 분획은 지단백질, apolipoproteins, proteomes 및 시험관내 배양된 세포를 가진 지단백질의 기능적인 연구 결과에 이용될 수 있습니다. 여기서, 우리는 VLDL (d&1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDL (d=1.04 및 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, 및 1.21 g/mL)를 포함하는 7개의 지단백질 분획을 격리하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 또한, SDS-PAGE 및 서양 블로팅에 의해 아포아-I, apoB 및 apoE와 같은 아포포단백질을 분석하고 고지립 토끼 모델을 사용하여 지단백질 및 아폴리포단백질 프로파일의 대표적인 결과를 보여주는 방법을 독자에게 소개합니다. 이 방법은 임상의와 기초 과학자 모두에게 지단백질 기능을 분석하는 표준 프로토콜이 될 수 있습니다.

Introduction

이상지질혈증은 세계에서 죽상 경화성 질환의 주요 위험 요소입니다. 저밀도 지단백(LdL) 및 저농도 고밀도 지단백(HDL)의 높은 수준은 관상 동맥 심장질환(CHD)1,2의고위험과 밀접한 관련이 있다. 임상 환경에서, LDL 콜레스테롤(LDL-C)과 HDL-콜레스테롤(HDL-C)은 임상 실험실3,4에서자동화된 분석기를 사용하여 일상적으로 측정된다. 그럼에도 불구 하 고, 이상 지질 혈 증의 진단 및 인간 및 실험 동물에 지질 대사와 동맥 경화증의 연구에 대 한 세부 사항에 지 단 단 프로파일을 분석 하는 것이 필수적이다. 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피[빠른 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)], 아가로즈 및 다극성 겔, 핵자기 공명, 선택적 화학적 흡기 등의 플라즈마 지단백질을 분석하는 몇 가지 방법이 보고되었다. 1950년대에 하벨 그룹은 먼저 초원심분리를 사용하여 밀도에 의해 정의된 지단백질개념을 제안하고 chylomicrons(CM), 매우 저밀도 지단백(VLDL), 중밀도 지단백질(IDL), LDL 및 HDL5로 분류하여 다른그룹,6개군에 의해 더 수정되었다. 지금까지, 초원심 분리는 실용적인 프로토콜을 아직 사용할 수없는 동안 가장 인기 있고 신뢰할 수있는 방법입니다. 이 논문에서는 이전에 설명한 순차 밀도 부동 초원심분리기를 사용하여 소량의 플라즈마를 격리하기 위한 사용하기 쉬운 프로토콜을 설명하려고시도하였다. 7개의 플라즈마 지단백질 분획 [VLDL(d&1.006 g/mL), IDL(d=1.02 g/mL), LDL(d=1.04 및 1.06 g/mL), HDL(d=1.08), HDL(d=1.08) 1.10, 및 1.21 g/mL)]을 통해 연구자들은 지단백질과 그들의 조성성 아폴리포단백질9,10,11모두에대한 광범위한 분석을 할 수 있다. 그대로 7개의 연속밀도 지단백은 지단백질 기능을 분석하고 세포 기반 체외 전략에도 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 임상 진단과 기본 연구 모두에 유용해야합니다. 여기서 우리는 토끼 플라즈마를 다른 종의 플라즈마가 동일한 방식으로 적용 할 수있는 동안이 기술을 입증하는 예로 사용했습니다.

Protocol

토끼 연구를위한 모든 절차는 야마나시 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인으로 수행되었다 (승인 번호: A28-39). 1. 토끼 혈액에서 플라즈마 분리 혈액 수집을 위해 0.5 M EDTA (pH 8.0)의 15 μL을 포함하는 1.5 mL 마이크로튜브를 준비하십시오. 토끼를 제지에 넣고 22 게이지 바늘을 사용하여 대동맥 중간 동맥에 구멍을 뚫고 튜브에 혈액을 수집합니다. EDTA와 혈액…

Representative Results

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 플라즈마의 1 mL를 사용하여 토끼 지단백질을 격리하고 일곱 밀도 분획을 얻었다. 고립 된 밀도 분획은 대부분의 연구 목적을 위해 위에서 설명한 것과 같이 지질과 아폴리포단백질을 측정하기에 충분합니다. 동일한 절차는 또한 인간과 그밖 종에서 플라즈마 지단백질을 격리하기 위해 이용될 수 있습니다. 마우스와 같은 작은 크기의 동물의 경우 풀링 된 플라즈?…

Discussion

고지혈증은 동맥 경화성 질환의 가장 중요한 위험 요소 중 하나입니다. 따라서, 플라즈마 지단백질의 분석은 이상지질혈증 환자의 진단에 필수적일 뿐만 아니라 지단백질 대사와 죽상 동맥 경화증의 분자 기계장치의 조사에또한 중요합니다. 이 연구에서는 극심분리가 가능한 실험실에서 적용될 수 있는 혈장 지단백질의 격리 및 분석 프로토콜을 설명했습니다. 이 방법에 의해 얻은 정보는 포괄?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 JSPS KAKENHI 그랜트 번호 JP 20K08858, 중국 국립 자연과학 재단 (81941001 및 81770457) 일본 – 중국 연구 협력 프로그램에 따라 JSPS-CAS의 연구 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다.

Materials

22-gauge needle Terumo NN-2232S For blood collection
96-well microplate greiner bio-one 655101 For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibody LifeSpan BioSciences LS-C314186 For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibody ROCKLAND 600-101-111 For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibody Merck Millipore AB947 For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 299-50101 For apolipoprotein analysis
Centrifuge HITACHI himac CF15RN
Closure Spectrum 132736 For lipoprotein dialysis
Dialysis tubing FUJIFILM Wako Pure Chemical 043-30921 For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat block Major Science MD-01N For SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 For Western blotting
Electrophoresis Chamber BIO-RAD Mini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate FUJIFILM Wako Pure Chemical 345-01865 For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paper ADVANTEC 590 For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotor BECKMAN COULTER 357656 TLA-120.2
Fixing solution For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbrane BIO-RAD 1620177 For Western blotting
Lumino image analyzer GE Healthcare For Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrer ADVANTEC SR-304 For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARK BIO-RAD For lipids measurment
Microtube INA-OPTIKA SC-0150
Orbital agitator USBDbo Stovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibody Jackson ImmunoResearch 705-035-003 For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 715-035-150 For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 433-36201 For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge Tubes BECKMAN COULTER 343778
Potassium Bromide FUJIFILM Wako Pure Chemical 168-03475 For density solution
Power Supply BIO-RAD For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra BIO-RAD 161-0377 For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainer Natsume Seisakusho KN-318 For blood collection
Rotor HITACHI T15A43
SDS-PAGE running buffer 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x) 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel 4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powder FUJIFILM Wako Pure Chemical 190-12865 For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 439-17501 For lipids measurment
Triglyicerides assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 432-40201 For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tube BECKMAN COULTER 347960 For lipoprotein isolation
Tween 20 SIGMA-ALDRICH P1379 For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
Ultracentrifuge BECKMAN COULTER A95761 Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer system BIO-RAD Mini Trans-Blot Cell

References

  1. Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
  2. Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
  3. Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
  4. Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
  5. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
  6. Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
  7. Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
  8. Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
  9. Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
  10. Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
  11. Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
  12. Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
  13. Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
  14. Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
  15. Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
  16. von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
  17. Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
  18. Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
  19. De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
  20. Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).

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Citer Cet Article
Niimi, M., Yan, H., Chen, Y., Wang, Y., Fan, J. Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation. J. Vis. Exp. (167), e61790, doi:10.3791/61790 (2021).

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