Summary

בידוד וניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה על ידי Ultracentrifugation

Published: January 28, 2021
doi:

Summary

מספר שיטות שימשו לניתוח ליפופרוטאינים פלזמה; עם זאת, ultracentrifugation היא עדיין אחת השיטות הפופולריות והאמינים ביותר. כאן, אנו מתארים שיטה לגבי איך לבודד ליפופרוטאינים מפלזמה באמצעות ultracentrifugation צפיפות רציפה וכיצד לנתח את apolipoproteins הן למטרות אבחון ומחקר.

Abstract

ניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה ו apolipoproteins הוא חלק חיוני לאבחון של דיסליפידמיה ומחקרים של חילוף החומרים של השומנים וטרשת עורקים. אמנם ישנן מספר שיטות לניתוח ליפופרוטאינים פלזמה, ultracentrifugation היא עדיין אחת השיטות הפופולריות והאמינות ביותר. בגלל הליך ההפרדה שלם שלה, שברי ליפופרוטאין מבודד בשיטה זו ניתן להשתמש לניתוח של ליפופרוטאינים, apolipoproteins, פרוטאומים, ומחקר פונקציונלי של ליפופרוטאינים עם תאים מתורבתים במבחנה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבודד שבעה שברי ליפופרוטאין כולל VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d = 1.02 g / mL), LDLs (d = 1.04 ו 1.06 g / mL), HDLs (d = 1.08, 1.10, ו 1.21 g/mL) מפלזמת ארנב באמצעות ultracentrifugation צף רציף. בנוסף, אנו מציגים לקוראים כיצד לנתח אפוליפופרוטאינים כגון apoA-I, apoB, ו apoE על ידי SDS-PAGE ו blotting המערבי ולהראות תוצאות מייצגות של פרופילי ליפופרוטאין ו apolipoprotein באמצעות מודלים ארנב היפרליפידמי. שיטה זו יכולה להפוך לפרוטוקול סטנדרטי הן עבור רופאים והן עבור מדענים בסיסיים כדי לנתח פונקציות ליפופרוטאין.

Introduction

דיסליפידמיה היא גורם הסיכון העיקרי של מחלה טרשת עורקים בעולם. רמות גבוהות של ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה (LDLs) ורמות נמוכות של ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה (HDLs) קשורים קשר הדוק עם סיכון גבוה למחלות לב כלילית (CHD)1,2. בסביבה הקלינית, הן LDL-כולסטרול (LDL-C) והן HDL-כולסטרול (HDL-C) נמדדים באופן שגרתי באמצעות מנתח אוטומטי במעבדה קלינית3,4. למרות זאת, חיוני לנתח פרופילי ליפופרוטאין בפרטים לאבחון דיסליפידמיה וחקר חילוף החומרים של השומנים וטרשת עורקים בבעלי חיים אנושיים וניסיוניים. דווח על מספר שיטות לניתוח ליפופרוטאינים מפלזמה כגון אולטרה-צנטריפוגציה, כרומטוגרפיה של הדרת גודל [כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהירה (FPLC) וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC)], אלקטרופורזה על ידי ג’לים אגרוז ופוליאקרילמיד, תהודה מגנטית גרעינית ומשקעים כימיים סלקטיביים באמצעות פוליאניונים ואקציות דו-כיווניות או כימיקלים אחרים. בשנת 1950, הקבוצה של האוול הציעה לראשונה את המושג ליפופרוטאינים המוגדרים על ידי צפיפויות באמצעות ultracentrifugation וסיווגה אותם לצ’ילומיקרונים (CM), ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL), ליפופרוטאינים בצפיפות בינונית (IDL), LDL ו- HDL5 ואילך, השיטה שונתה עוד יותר על ידי קבוצות אחרות6,7. עד כה, ultracentrifugation היא השיטה הפופולרית והאמינה ביותר בעוד הפרוטוקול המעשי עדיין אינו זמין. במאמר זה, ניסינו לתאר פרוטוקול קל לשימוש לבידוד קנה מידה קטן של פלזמה באמצעות ultracentrifugation צף צפיפות רציפה שתואר במקורבעבר 8. בידוד של שבעה שברי ליפופרוטאין פלזמה [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d = 1.02 g / mL), LDLs (d = 1.04 ו 1.06 g / mL), HDLs (d = 1.08, 1.10, ו 1.21 g/mL)] מאפשר לחוקרים לבצע ניתוח מקיף של ליפופרוטאינים והן של אפוליפופרוטאינים קומפוזיציוניים שלהם9,10,11. שלם שבעה ליפופרוטאינים בצפיפות רצופה ניתן להשתמש לניתוח פונקציות ליפופרוטאין וגם משרתים תא מבוסס במבחנה אסטרטגיות. פרוטוקול זה צריך להיות שימושי הן לאבחון קליני והן למחקר בסיסי. כאן השתמשנו פלזמה ארנב כדוגמה כדי להדגים טכניקה זו בעוד פלזמה ממינים אחרים ניתן ליישם באותו אופן.

Protocol

כל ההליכים ללימודי ארנבות בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת יאמנשי (מספר מאושר: A28-39). 1. הפרדת פלזמה מדם ארנב הכן 1.5 צינורות מ”ל המכילים 15 μL של 0.5 M EDTA (pH 8.0) לאיסוף דם. שים ארנב במרסן לנקב עורק ביניים auricular באמצעות מחט 22 מד ולאסוף דם לתוך צינור. מ…

Representative Results

באמצעות פרוטוקול זה, בודדנו ליפופרוטאינים ארנב באמצעות 1 מ”ל של פלזמה והשגנו שבעה שברי צפיפות. שברי צפיפות מבודדים מספיקים למדידת שומנים ואפוליפופרוטאינים כמתואר לעיל לרוב מטרות המחקר. אותו הליך יכול לשמש גם עבור בידוד ליפופרוטאינים פלזמה ממינים אנושיים ואחרים. עבור בעלי חיים קטנים כגון …

Discussion

היפרליפידמיה היא אחד מגורמי הסיכון החשובים ביותר של מחלה טרשת עורקים. לכן, ניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה הוא לא רק חיוני לאבחון של חולי דיסליפידמיה, אלא גם חשוב לחקירה של מנגנונים מולקולריים של חילוף החומרים ליפופרוטאין וטרשת עורקים. במחקר זה, תיארנו את הפרוטוקול של בידוד וניתוח של ליפופר?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי מחקר מ JSPS KAKENHI גרנט מספר JP 20K08858, הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘81941001 ו 81770457), JSPS-CAS תחת התוכנית השיתופית מחקר יפן-סין.

Materials

22-gauge needle Terumo NN-2232S For blood collection
96-well microplate greiner bio-one 655101 For lipids measurment
Anti-apolipoprotein A-I antibody LifeSpan BioSciences LS-C314186 For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein B antibody ROCKLAND 600-101-111 For Western blottng, use 1:1,000
Anti-apolipoprotein E antibody Merck Millipore AB947 For Western blottng, use 1:1,000
CBB staining kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 299-50101 For apolipoprotein analysis
Centrifuge HITACHI himac CF15RN
Closure Spectrum 132736 For lipoprotein dialysis
Dialysis tubing FUJIFILM Wako Pure Chemical 043-30921 For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000
Dry heat block Major Science MD-01N For SDS-PAGE sample preparation
ECL Western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 For Western blotting
Electrophoresis Chamber BIO-RAD Mini-PROTEAN Tetra Cell
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate FUJIFILM Wako Pure Chemical 345-01865 For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM)
Filter paper ADVANTEC 590 For Western blotting
Fixed angle ultracentrifuge rotor BECKMAN COULTER 357656 TLA-120.2
Fixing solution For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid)
Immun-Blot PVDF menbrane BIO-RAD 1620177 For Western blotting
Lumino image analyzer GE Healthcare For Western blotting, ImageQuant LAS 4000
Magnetic stirrer ADVANTEC SR-304 For lipoprotein dialysis
Microplate reader iMARK BIO-RAD For lipids measurment
Microtube INA-OPTIKA SC-0150
Orbital agitator USBDbo Stovall Life Science
Peroxidase congugated anti goat IgG antibody Jackson ImmunoResearch 705-035-003 For Western blotting, use 1:2,000
Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 715-035-150 For Western blotting, use 1:2,000
Phospholipids assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 433-36201 For lipids measurment
Polycarbonate ultracentrifuge Tubes BECKMAN COULTER 343778
Potassium Bromide FUJIFILM Wako Pure Chemical 168-03475 For density solution
Power Supply BIO-RAD For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC
Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra BIO-RAD 161-0377 For SDS-PAGE and Western blotting
Rabbit restrainer Natsume Seisakusho KN-318 For blood collection
Rotor HITACHI T15A43
SDS-PAGE running buffer 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS
SDS-PAGE sample buffer (2x) 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol
SDS-polyacrylamide gel 4-20% gradient polyacrylamide gel
Skim milk powder FUJIFILM Wako Pure Chemical 190-12865 For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS)
Total cholesterol assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 439-17501 For lipids measurment
Triglyicerides assay kit FUJIFILM Wako Pure Chemical 432-40201 For lipids measurment
Tube slicer for thick-walled tube BECKMAN COULTER 347960 For lipoprotein isolation
Tween 20 SIGMA-ALDRICH P1379 For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS)
Ultracentrifuge BECKMAN COULTER A95761 Optima MAX-TL
Western blotting wet transfer system BIO-RAD Mini Trans-Blot Cell

References

  1. Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
  2. Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
  3. Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
  4. Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
  5. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
  6. Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
  7. Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
  8. Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
  9. Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
  10. Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
  11. Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
  12. Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
  13. Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
  14. Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
  15. Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
  16. von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
  17. Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
  18. Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
  19. De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
  20. Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).

Play Video

Citer Cet Article
Niimi, M., Yan, H., Chen, Y., Wang, Y., Fan, J. Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation. J. Vis. Exp. (167), e61790, doi:10.3791/61790 (2021).

View Video