Summary

Эффективная дифференциация постгонглионических симпатических нейронов с использованием человеческих плюрипотентных стволовых клеток в соответствии с безкормовыми и химически определенными условиями культуры

Published: May 24, 2020
doi:

Summary

В этом протоколе мы описываем стабильную, высокоэффективную стратегию дифференциации для генерации постганглионических симпатических нейронов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Эта модель сделает нейроны доступными для использования исследований множественных вегетативных расстройств.

Abstract

Плюрипотентные стволовые клетки человека (HPSCs) стали мощным инструментом для моделирования заболеваний и изучения эмбрионального развития человека в пробирке. Ранее мы представили протокол дифференциации для производности вегетативных нейронов с симпатическим характером, который был применен к пациентам с вегетативной невропатией. Тем не менее, протокол был построен на Knock Out Сыворотки Замена (KSR) и фидер основе условий культуры, и для обеспечения высокой эффективности дифференциации, сортировка клеток была необходима. Эти факторы вызывают высокую изменчивость, высокую стоимость и низкую воспроизводимость. Кроме того, не были проверены зрелые симпатические свойства, в ключая электрическая активность. Здесь мы представляем оптимизированный протокол, в котором культура и дифференциация PSC выполняются в условиях культуры, свободной от фидера и химически определенных. Идентифицированы генетические маркеры, идентифицирующие нервный гребень ствола. Дальнейшая дифференциация на постгнилионические симпатические нейроны достигается через 20 дней без необходимости сортировки клеток. Электрофизиологическая запись дополнительно показывает функциональную идентичность нейронов. Стрельба, обнаруженная у наших дифференцированных нейронов, может быть усилена никотином и подавлена атранергическим антагонистом-антагонистом. Промежуточные симпатические нейронные прародители в этом протоколе могут быть сохранены в качестве нейронных сфероидов на срок до 2 недель, что позволяет расширить культуры. В целом, наш обновленный протокол дифференциации нейронов показывает высокую эффективность дифференциации, лучшую воспроизводимость, большую гибкость и лучшее созревание нейронов по сравнению с предыдущей версией. Этот протокол предоставит исследователям клетки, необходимые для изучения человеческих расстройств, которые влияют на вегетативную нервную систему.

Introduction

Постганглионические симпатические нейроны (симны) принадлежат к вегетативной нервной системе (ANS) и играют несколько важных ролей в реагировании и регулировании гомеостаза тела, независимого от сознания. Например, стресс стимулирует симны и вызывает ответ на борьбу или полет, что приводит к увеличению частоты сердечных приступов, артериального давления и потоотделения. Символы страдают от множественных расстройств человека из-за генетики, токсичности / травмы, или в качестве компаньонов к другим заболеваниям. Примером генетической невропатии является детское расстройство семейной дисавтотомии (FD), где тяжелая дисрегуляция симн вызывает дистостентомический кризис, очевидный потливость, пятно кожи, рвота приступы, гипертония, и тревога1. Примером токсичности является химиотерапия, которая, как сообщается, имеют токсические побочные эффекты на вегетативные нейроны2. Известно, что вегетативная денервация и гипериннервация могут привести к или сопровождать такие заболевания, как болезнь Паркинсона или гипертоническая почечная болезнь3,4. Таким образом, возможность проводить исследования и понимать механизмы симН биологии и дефектов в контексте болезни полезно для поиска новых и эффективных методов лечения.

Анатомии
Периферическая нервная система ветвится в сенсорные и вегетативные деления. Афферентные нервы сенсорной нервной системы отвечают за ощущение боли и прикосновения, в то время как ANS отвечает за передачу информации из всех органов в мозг. АНС делится на кишечную нервную систему, иннерватирующую желудочно-кишечный тракт, парасимпатическую нервную систему, что важно для расслабления, и симпатическую нервную систему (СНС), что важно для активации/регулирования органов. SNS адаптирует двухнейронную систему5. Преганглионические симпатические нейронные аксоны в спинном мозге сначала проект симпатической ганглиев, где postganglionic симН клеточные тела расположены. Эти нейроны затем отправить длинные прогнозы для innervate целевых тканей каждого органа в организме. Сигналы, передаваемые преганглионическими нейронами, являются холинергическими, в то время как постганглионические симнявляются являются адренергическими и, таким образом, выражают норадреналин (NE) в качестве основного нейромедиатора. Есть несколько заметных исключений постгонглионических, симпатических нейронов, которые холинергических, в том числе те, иннервируя кровеносные сосуды. Adrenergic postganglionic нейроны выражают ферменты тирозин гидроксилаза (TH), ароматические L-аминокислоты декарбоксилаза (AAAD), допамина – гидроксилаза (DBH), и моноамин оксидаза (МАО-А), все отвечает за генерацию и метаболизацию NE. Кроме того, они выражают NE рециркуляции транспортеров и / или рецепторов – adrenergic рецепторов (ADRA2), к-адренергический рецептор (ADR2B), норадреналин транспортер (NET1), и везикулярный моноамин транспортер (VMAT1/2).

Развития
Во время эмбрионального развития симны являются производными от нервного гребня (NC), который возникает между нервной трубки и наложения эктодерм6, и может дифференцировать в нескольких клеточных линий, в том числе меланоцитов, остеобластов, адипоцитов, глия, энтерические нейроны, сенсорные нейроны, и вегетативые нейроны7. Нейронные клетки гребня (NCCs) высоки мигрирующие клетки которые принимают несколько путей через зародыш. На этой ранней стадии развития NC, клетки выражают маркеры SNAIL1’2, FOXD3, и SOX108,,9,,10,11. Маршрут миграции вместе с их осевым местоположением определяет подтип NC, в который они будут развиваться. Эти подтипы NC можно отличить по их специфической экспрессии генов HOX: крякные NCCs не выражают гены HOX, неисправные NCCs выражают HOX 1-5, хоботные NCCs выражают HOX 6-9, и сакральные NCCs выражают HOX 10-1112. Среди них магистральные НКК признаны основным источником симнов. Предшественники SymN выражают транскрипционный фактор MASH1/ASCL113, который способствует выражению PHOX2B14 и INSM115. Семейство транскрипционных факторов GATA выражается во время позднего сочувственного развития. GATA2 и GATA3 выражены в симнях, которые, в свою очередь, активируют DBH16. Коэффициент транскрипции HAND2 также важен для выражения и поддержания DBH и TH17.

HPSCs (например, эмбриональные и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки) являются мощным инструментом18 для повторения парадигм развития и создания симнов, которые затем могут быть использованы для моделирования заболеваний различных человеческих расстройств. Таким образом, создавая симнизмы из HPSC, крайне важно следовать руководящим принципам развития и оценивать выражение соответствующих маркеров в процессе дифференциации.

Предыдущий протокол symN
Немногие исследовательские группы ранее сообщали о генерации симнов из hPSCs19,,20,,21. Прямое сравнение этих протоколов друг с другом и нашими был рассмотрен недавно22. В 2016 году23, мы опубликовали протокол дифференциации для поколения вегетативных нейронов с символом symN(рисунок 1A). В этом протоколе использовалась среда на основе КСР, которая использовалась как в поддержании недифференцированных hPSCs, так и в дифференциации клеток. Кроме того, hPSCs были сохранены на мыши эмбриональных фибробластов (MEF фибробластов). Мы использовали этот протокол и PSCs от пациентов с FD для моделирования расстройства23. В 2019 году мы описали более подробную версию этого старогопротокола 24. Таким образом, нервная судьба была вызвана двойным ингибированием SMAD25, чтобы блокировать TGF-я и BMP сигнализации в первые 2 дня. Активация WNT с использованием CHIR99021 способствовала нейронных прародителей, чтобы стать nc-клетками. На 11-й день, клетки были отсортированы FACS для CD49D+ или SOX10 популяций26,23, что дало около 40% NC эффективности генерации. Таким образом, сортировка была необходима для обеспечения эффективности и чистоты для следующих шагов дифференциации. NCCs были сохранены и усилены как сфероиды с комбинированным лечением FGF2 и CHIR. После 4 дней, NC сфероидов обслуживания были покрыты и с учетом BDNF, GDNF, и NGF, чтобы закончить созревание symN. Хотя эти символы выразили сильные символы, такие как ASCL1, TH, DBH и PHOX2A, маркеры для более зрелых симнов, включая выражение никотинового ацетилхолина (CHRNA3/CHRNB4) и везикальный транспортер (VMAT1/2), были низкими даже после 70 дней дифференциации. Гены HOX в этом протоколе не были официально протестированы, а зрелые нервные свойства, включая электрофизиологическую активность клеток, не были проверены.

Здесь мы представляем оптимизированный протокол для генерации симнов(рисунок 1B). HPSCs поддерживаются в условиях фидер-бесплатно, на витронектин (VTN) покрытием блюда, используя Основные 8 (E8) СМИ27. Формула дифференциации средств массовой информации была изменена на каждом этапе, тем самым увеличивая процент населения NC28. Созревание symN может быть выполнено на+CD49D /SOX10 отсортированных или несортированных популяциях NCC. Оба показывают высокий уровень выражения маркера symN к 30-му дню. Кроме того, симны, генерируемые с помощью этого протокола, реагируют на электрофизиологическую запись и на лечение симН-активатором и ингибиторными соединениями.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: H9 PHOX2B: GFP репортер линия была предоставлена Oh et al.19. Некоторые праймеры qPCR, используемые в этой работе, были получены от OriGene Technologies, в то время как несколько последовательностей получены из Frith et al.20,30. 1. Настройка для п?…

Representative Results

В этом протоколе мы даем инструкции о том, как генерировать симнизмы из hPSCs. Культурные условия, продемонстрировавшиеся здесь, были улучшены по мимо ранее опубликованного протокола23,,24 (рисунок 1A)до условий, не связанных с подачей и химиче?…

Discussion

Недавно мы опубликовали два обзора, один из которых обсуждал использование симн-симнов, полученных hPSC, для моделирования заболеваний31, а также углубленное сравнение доступных протоколов дифференциации22. Таким образом, здесь мы сосредоточимся на устранении н?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Хайди Ульрихс за критическое чтение и редактирование рукописи.

Materials

100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-DAPI antibody Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

References

  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity–focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Biologie du développement. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. . Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Biologie du développement. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

Play Video

Citer Cet Article
Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

View Video