在无馈体和化学定义的培养条件下，使用人类多能干细胞的后多能感感神经元的有效分化

后刚体交感神经元（symNs）属于自主神经系统（ANS），在独立于意识的个体的反应和调节平衡方面具有多重重要作用。例如，压力刺激symN，并唤起战斗或逃跑的反应，导致心率，血压和出汗的增加。SymNs 因遗传、毒性/伤害或其他疾病的同伴而在多种人类疾病中受到影响。遗传神经病变的一个例子是儿童疾病家庭性肌瘤（FD），其中，严重的调节调节的共生导致反乌托邦危机，明显的出汗，皮肤斑点，呕吐发作，高血压和焦虑^1。毒性的一个例子是化疗治疗，据报道，它对自主神经元有毒副作用^2。众所周知，自主变性和超内侧病既可导致或伴随，如帕金森病或高血压肾病^33，4。4因此，能够进行研究，了解symN生物学的机制和疾病背景下的缺陷，有利于寻找新颖有效的治疗方法。

解剖
外围神经系统分支成感官和自主的分裂。感觉神经系统的发泡神经负责疼痛和触觉的感觉，而ANS负责将信息从所有器官中继到大脑。ANS分为肠神经系统，内化胃肠道，寄生神经系统，这是放松的重要，和寄分神经系统（SNS），这是重要的激活/调节器官。SNS 调整双神经元系统⁵。前刚利感神经斧头在脊髓第一个项目到交感性神经神经神经斧子，其中后刚体symN细胞体的位置。然后，这些神经元发送长投影，以内化身体中每个器官的目标组织。由前江柱神经元传输的信号是胆碱化的，而后江脂符号是可德雷纳的，因此表达去甲肾上腺素（NE）作为其主要神经递质。很少有明显的例外，后血管，同情神经元是胆碱化，包括那些内化血管。腺素后神经神经元表达酶酪氨酸羟基酶（TH），芳香L-氨基酸脱氧血脂酶（AAAD），多巴胺β-羟基酶（DBH），和单胺氧化酶（MAO-A），所有负责产生和代谢NE。此外，它们还表达NE回收运输机和/或受体β-肾上腺素受体（ADRA2）、β-肾上腺素受体（ADR2B）、去甲肾上腺素输送器（NET1）和光体单胺输送器（VMAT1/2）。

发展
在胚胎发育过程中，符号来自神经峰（NC），神经管和覆盖的ectoderm⁶之间出现，可以分化成多个细胞谱系，包括黑色素细胞、骨细胞、副细胞、胶质、肠神经元、感觉神经元和自主神经元^7。神经峰细胞（NCCs）是高度迁移的细胞，通过胚胎走几条途径。在NC发育的早期阶段，细胞表示标记SNAIL1/2、FOXD3和SOX10^{88、9、10、11。9,10,11}迁移路线以及它们采用的轴向位置决定了它们将发展到的 NC 子类型。这些NC亚型可以通过其特定的HOX基因表达来区分：颅内NCC不表达HOX基因，vagal NCC表达HOX1+5，中继NCCs表达HOX6+9，以及食质NCC表达HOX10~11^12。其中，中继NcC被公认为是符号的主要来源。SymN 前体表示转录因子 MASH1/ASCL1^13，它促进 PHOX2B¹⁴和 INSM1¹⁵的表达。《国家与加体刑部》的转录因子家族在晚期同情发展期间表达。GATA2 和 GATA3 表示在符号中，然后激活 DBH¹⁶。转录因子HAND2对DBH和^TH17的表达和维护也很重要。

HPSC（例如胚胎和诱导多能干细胞）是一个强大的工具^18，用于概括发展范式并生成符号，然后可用于各种人类疾病的疾病建模。因此，在从 hPSC 生成符号的同时，必须遵循发展准则，并评估在差别化过程中表达适当的标记。

以前的 symN 协议
很少有研究小组以前曾报告过^{hPSC19、20、21,20,21}的共生生成。最近²²年，我们审查了这些协议与彼此的直接比较。2016^年23月，我们发布了一种分化协议，用于生成具有symN字符的自主神经元（图1A）。该协议使用基于KSR的介质，用于维持无差别的hPSCs和细胞分化。此外，在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF馈送细胞）上维持hPSCs。我们使用这个协议和PSC从FD患者建模紊乱^23。在2019年，我们描述了这个旧协议²⁴的更详细的版本。综上所述，神经命运是由双SMAD抑制²⁵在前2天阻止TGF-β和BMP信号诱导的。使用CHIR99021进行WNT激活促进神经祖细胞成为NC细胞。第11天，通过FACS对CD49D+或⁺SOX10=种群^26，23,23的细胞进行排序，产生了约40%的NC生成效率。⁺因此，需要分拣以确保下一步差异化的效率和纯度。通过FGF2和CHIR的组合处理，将NCC作为球体进行维护和放大。4天后，对维护的NC球体进行镀层，并给予BDNF、GDNF和NGF，以完成symN成熟。虽然这些符号表示强烈的symN标记，如ASCL1，TH，DBH和PHOX2A，更成熟的符号，包括尼古丁乙酰胆碱受体（CHRNA3/CHRNB4）和囊泡运输器（VMAT1/2）的表达，即使在70天的分化后，也很低。该协议中的HOX基因没有经过正式测试，成熟的神经特性，包括细胞的电生理活性，未经验证。

在这里，我们提出了一个优化的协议来生成符号（图1B）。HPSC 在无馈送条件下保持，在体外内他丁 （VTN） 涂层的菜肴上，使用基本 8 （E8） 介质²⁷。分化介质的公式在每个阶段都进行了修改，从而增加了NC人口²⁸的百分比。symN 成熟可以在 CD49D⁺/SOX10⁼排序或未排序的散装 NCC 种群上完成。两者都显示第 30 天的高级别 symN 标记表达式。此外，使用该协议生成的符号对电生理记录和使用symN活化剂和抑制剂化合物的处理有反应。