Summary

تمايز فعال من الخلايا العصبية المتعاطفة Postganglionic باستخدام الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات تحت ظروف الثقافة خالية من التغذية والمحددة كيميائيا

Published: May 24, 2020
doi:

Summary

في هذا البروتوكول، ونحن نصف مستقرة، استراتيجية تمايز عالية الكفاءة لتوليد الخلايا العصبية متعاطفة ما بعد ganglionic من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية. هذا النموذج سيجعل الخلايا العصبية المتاحة لاستخدام الدراسات من اضطرابات غير ذات سيادة متعددة.

Abstract

أصبحت الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) أداة قوية لنمذجة الأمراض ودراسة النمو الجنيني البشري في المختبر. قدمنا سابقا بروتوكول التمايز لاشتقاق الخلايا العصبية اللاإراية مع الطابع المتعاطف الذي تم تطبيقه على المرضى الذين يعانون من الاعتلال العصبي اللاإراجي. ومع ذلك ، تم بناء البروتوكول على استبدال مصل الضرب (KSR) وظروف الثقافة القائمة على التغذية ، ولضمان كفاءة التمايز العالية ، كان فرز الخلايا ضروريًا. هذه العوامل تسبب تقلب عالية، وارتفاع التكلفة، وانخفاض الاستنساخ. وعلاوة على ذلك، لم يتم التحقق من الخصائص المتعاطفة الناضجة، بما في ذلك النشاط الكهربائي. هنا ، نقدم بروتوكولًا مثاليًا حيث يتم تنفيذ ثقافة PSC والتمايز في ظروف ثقافة خالية من التغذية ومحددة كيميائيًا. يتم تحديد العلامات الوراثية التي تحدد قمة الجذع العصبية. ويتحقق مزيد من التمايز في الخلايا العصبية المتعاطفة ما بعد ganglionic بعد 20 يوما دون الحاجة إلى فرز الخلايا. تسجيل الكهربية تظهر كذلك هوية الخلايا العصبية الوظيفية. يمكن تعزيز إطلاق النار المكتشف ة من الخلايا العصبية المتمايزة لدينا عن طريق النيكوتين وقمعها من قبل مستقبلات الأدينرجية خصم بروبرانولول. يمكن الحفاظ على السلف العصبية المتعاطفة المتوسطة في هذا البروتوكول كسفيرات عصبية لمدة تصل إلى أسبوعين ، مما يسمح بتوسيع الثقافات. باختصار، لدينا تحديث بروتوكول التمايز العصبية المتعاطفة يظهر كفاءة التمايز عالية، واستنساخ أفضل، والمزيد من المرونة، وتحسين النضج العصبي مقارنة مع الإصدار السابق. هذا البروتوكول سوف توفر للباحثين مع الخلايا اللازمة لدراسة الاضطرابات البشرية التي تؤثر على الجهاز العصبي اللاإرادي.

Introduction

الخلايا العصبية المتعاطفة بعد ganglionic (symNs) تنتمي إلى الجهاز العصبي اللاإراجي (ANS) ولها أدوار هامة متعددة في الاستجابة وتنظيم التوازن في الجسم مستقلة عن الوعي. على سبيل المثال، يحفز الإجهاد السمنون ويثير استجابة القتال أو الطيران التي تؤدي إلى زيادة في معدل ضربات القلب وضغط الدم والتعرق. تتأثر SymNs في اضطرابات بشرية متعددة بسبب علم الوراثة أو السمية / الإصابة ، أو كمرافقين لأمراض أخرى. مثال على الاعتلال العصبي الوراثي هو اضطراب الطفولة Dysautonomia (FD) ، حيث يؤدي خلل التنظيم الشديد للsymNs إلى أزمة dysautonomic ، واضحة من خلال التعرق ، لطخة الجلد ، نوبات القيء ، ارتفاع ضغط الدم ، والقلق1. مثال على السمية هو العلاج الكيميائي، الذي أفيد أن له آثار جانبية سامة على الخلايا العصبية اللاإراية2. ومن المعروف أن الإرادي اللاإرادي وفرط التعصيب يمكن أن يؤدي إلى، أو يرافق، أمراض مثل مرض باركنسون أو مرض الكلى ارتفاع ضغط الدم3,4. وبالتالي ، فإن القدرة على إجراء البحوث وفهم آليات علم الأحياء والعيوب في سياق المرض مفيد للبحث عن علاجات جديدة وفعالة.

تشريح
يتفرع الجهاز العصبي المحيطي إلى الانقسامات الحسية واللاإراسية. الأعصاب المنفأة في الجهاز العصبي الحسي هي المسؤولة عن الإحساس بالألم واللمس ، في حين أن ANS مسؤولة عن نقل المعلومات من جميع الأجهزة إلى الدماغ. وينقسم ANS إلى الجهاز العصبي المعوي، والداخلية في الجهاز الهضمي، والجهاز العصبي شبه متعاطف، وهو أمر مهم للاسترخاء، والجهاز العصبي المتعاطف (SNS)، وهو أمر مهم لتنشيط / تنظيم الأجهزة. SNS تتكيف مع نظام اثنين من الخلايا العصبية5. المحاور العصبية المتعاطفة قبل ganglionic في الحبل الشوكي المشروع الأول إلى ganglia متعاطفة، حيث توجد أجسام الخلية symN ما بعد ganglionic. ثم ترسل هذه الخلايا العصبية إسقاطات طويلة لإيوينال الأنسجة المستهدفة من كل عضو في الجسم. الإشارات التي تنتقل عن طريق الخلايا العصبية قبل الغانغليونية هي الكوليني، في حين أن symNs ما بعد الغانغليونية هي التحسسية وبالتالي التعبير عن النورادرينالين (NE) كناقل عصبي رئيسي. هناك استثناءات قليلة ملحوظة من الخلايا العصبية ما بعد ganglionic, متعاطفة التي هي الكوليني, بما في ذلك تلك الأوعية الدموية الداخلية. الخلايا العصبية الأيدرينرجية ما بعد ganglionic التعبير عن إنزيمات التيروزين هيدروكسيلاز (TH), العطرية L-الأمينية حمض decarboxylase (AAAD), الدوبامين α-هيدروكسيلاز (DBH), وأوكسيديز أحادي الأمين (MAO-A), جميع المسؤولة عن توليد واستقلاب NE. وعلاوة على ذلك، فإنها تعبر عن ناقلات إعادة التدوير NE و / أو مستقبلات α-adrenergic (ADRA2)، مستقبلات الأدريين (ADR2B)، الناقل النورادرينالين (NET1)، وناقل اليورياميني الفيمركب (VMAT1/2).

التنميه
خلال تطور الجنين ية يتم اشتقاق symNs من القمة العصبية (NC), الذي يظهر بين الأنبوب العصبي وتراكب ectoderm6,ويمكن أن تفرق في أنساب متعددة الخلايا, بما في ذلك الخلايا الصباغية, العظام الخلايا, الخلايا الدهنية, غليا, الخلايا العصبية المعوية, الخلايا العصبية الحسية, والخلايا العصبية اللاإروية7. خلايا القمم العصبية (NCCs) هي خلايا شديدة الارتحال تأخذ عدة طرق عبر الجنين. في هذه المرحلة المبكرة من NC التنمية، والخلايا التعبير عن علامات SNAIL1/2، FOXD3، وSOX108،9،10،11. يحدد مسار الترحيل مع الموقع المحوري الذي يتبنونه النوع الفرعي NC الذي ستتطور إليه. يمكن تمييز هذه الأنواع الفرعية NC من خلال التعبير الجيني HOX محددة: NCCs الجمجمة لا تعبر عن الجينات HOX, NCCs المبهمة التعبير HOX 1-5, NCCs الجذع التعبير HOX 6-9, وNCCs sacral التعبير HOX 10-1112. ومن بينها، يُعترف بمراكز الـ NCCs للجذع كمصدر رئيسي للسيومين. SymN السلائف التعبير عن عامل النسخ MASH1/ASCL113, الذي يعزز التعبير عن PHOX2B14 وINSM115. يتم التعبير عن عائلة GATA من عوامل النسخ أثناء التطور المتعاطف المتأخر. يتم التعبير عن GATA2 و GATA3 في symNs ، والتي بدورها ينشط DBH16. عامل النسخ HAND2 مهم أيضا للتعبير عن وصيانة DBH و TH17.

وخلايا HPSCs (مثل الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة) هي أداة قوية18 لتلخيص النماذج التنموية وتوليد الخلايا السلية التي يمكن استخدامها بعد ذلك لنمذجة الأمراض لمختلف الاضطرابات البشرية. وهكذا، فبينما تولد السيوم الوطني من المراكز الاستراتيجية الوطنية، من الأهمية بمكان اتباع المبادئ التوجيهية الإنمائية وتقييم التعبير عن العلامات المناسبة على طول عملية التمايز.

بروتوكول symN السابق
وقد ذكرت عدد قليل من مجموعات البحث سابقا توليد symNs من hPSCs19,20,21. المقارنة المباشرة لهذه البروتوكولات لبعضها البعض ولنا واستعرض مؤخرا22. في 201623, نشرنا بروتوكول التمايز لتوليد الخلايا العصبية اللاإراية مع حرف symN(الشكل 1A). استخدم هذا البروتوكول الوسيط القائم على KSR ، والذي تم استخدامه في كل من الحفاظ على hPSCs غير المتمايزة وتمايز الخلايا. وعلاوة على ذلك، تم الحفاظ على hPSCs على الخلايا الليفية الجنينية الماوس (الخلايا المغذية MEF). لقد وظفنا هذا البروتوكول وPSCs من المرضى الذين يعانون من FD لنموذج اضطراب23. في عام 2019 ، وصفنا نسخة أكثر تفصيلاً من هذا البروتوكول القديم24. باختصار ، تم حث المصير العصبي عن طريق تثبيط SMAD المزدوج25 لمنع إشارات TGF-α و BMP في اليومين الأولين. تعزيز تفعيل WNT باستخدام CHIR99021 السلف العصبية لتصبح خلايا NC. في اليوم 11، تم فرز الخلايا من قبل FACS لCD49D+ أو SOX10+ السكان26،23، والتي أسفرت عن حوالي 40٪ كفاءة الجيل NC. ومن ثم، فإن الفرز ضروري لضمان الكفاءة والنقاء للخطوات التالية للتمايز. تم الحفاظ على NCCs وتضخيمها كspheroids مع المعالجة المشتركة من FGF2 وCHIR. بعد 4 أيام، تم مطلي spheroids NC من الصيانة وأعطيت BDNF، GDNF، وNGF لإنهاء نضوج symN. على الرغم من أن هذه symNs أعرب عن علامات symN قوية مثل ASCL1, TH, DBH, و PHOX2A, علامات لsymNs أكثر نضجا, بما في ذلك التعبير عن مستقبلات الأستيل كولين النيكوتين (CHRNA3/CHRNB4) والناقل الحويصلة (VMAT1/2), كانت منخفضة حتى بعد 70 يوما من التمايز. لم يتم اختبار جينات HOX في هذا البروتوكول رسميًا ، ولم يتم التحقق من الخصائص العصبية الناضجة ، بما في ذلك النشاط الكهربي الفسيولوجي للخلايا.

هنا، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل لتوليد symNs(الشكل 1B). يتم الحفاظ على HPSCs في ظروف خالية من التغذية، على الأطباق المغلفة بالفيترونكتين (VTN)، باستخدام الوسائط الأساسية 8 (E8)27. وقد تم تعديل صيغة وسائل الإعلام التمايز في كل مرحلة، مما أدى إلى زيادة النسبة المئوية للسكان NC28. ويمكن القيام بنضوج symN على CD49D+/ SOX10+ فرزأو مجموعات NCC السائبة غير المصنفة. كلاهما تظهر مستويات عالية من التعبير علامة symN بحلول اليوم 30. وعلاوة على ذلك، فإن symNs ولدت مع هذا البروتوكول تستجيب للتسجيل الكهروفيزيولوجية والعلاجات مع المنشط symN والمركبات المثبطة.

Protocol

ملاحظة: تم توفير خط مراسل H9 PHOX2B:GFP من قبل Oh وآخرون19. تم الحصول على بعض التمهيديات qPCR المستخدمة في هذه الورقة من تقنيات OriGene ، في حين يتم الحصول على بعض التسلسلات من Frith et al.20،30. 1. إعداد لطلاء الأطباق، وإعداد وسائل الإعلام، وصيانة hPSC …

Representative Results

في هذا البروتوكول، نعطي تعليمات حول كيفية توليد symNs من hPSCs. تم تحسين ظروف الثقافة المثبتة هنا من بروتوكول نشر سابق23،24 (الشكل 1A)إلى شروط خالية من التغذية ومحددة كيميائيا(الشكل 1B). يتم توفير خيارين، واحد حيث يتم symNs في غضون 20 يوما…

Discussion

لقد نشرنا مؤخرا استعراضين، واحد مناقشة استخدام symNs المشتقة من hPSC لنمذجة المرض31، فضلا عن مقارنة متعمقة من بروتوكولات التمايز المتاحة22. وهكذا، هنا نركز على استكشاف الأخطاء وإصلاحها البروتوكول الحالي لمساعدة الباحث المهتم على النجاح في صنع symNs. خلال عملية التمايز ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر هايدي أولريش على القراءة النقدية وتحرير المخطوطة.

Materials

100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-DAPI antibody Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

References

  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity–focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Biologie du développement. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. . Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Biologie du développement. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

Play Video

Citer Cet Article
Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

View Video