Este artigo descreve um método para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por antígeno funcional do tumor derivadas de CD8αβ+ únicas células T positivas usando o sistema de cocultura OP9/DLL1.
A geração e expansão das células T funcionais in vitro pode levar a uma ampla gama de aplicações clínicas. Um desses usos é para o tratamento de pacientes com câncer avançado. A transferência de células T adotivas (ACT) de células T altamente enriquecidas do tumor específicas tem sido mostrada para causar regressão durável de câncer metastático em alguns pacientes. No entanto, durante a expansão, essas células podem ficar esgotadas ou senescentes, limitando sua função efetiva e persistência in vivo. A tecnologia induzida de células-tronco pluripotentes (iPSC) pode superar esses obstáculos levando à geração in vitro de um grande número de células T específicas de antígeno tumoral menos diferenciada. O iPSC humano (hiPSC) tem a capacidade de diferenciar-se em qualquer tipo de célula somática, incluindo linfócitos, que retêm o rearranjo genômico original do receptor de células T (TCR) quando uma célula T é usada como célula de partida. Portanto, a reprogramação de células T específicas de antígeno tumor humano para hiPSC seguida de redifferentiação à linhagem de células T tem o potencial de produzir células T específicas de antígeno tumoral rejuvenescido. Descrito aqui é um método para gerar células T CD8αβ+ únicas positivas (SP) positivas (SP) do hiPSC usando o sistema de cocultura OP9/DLL1. Este método é uma ferramenta poderosa para a geração in vitro da linhagem da pilha de T e facilitará o desenvolvimento de pilhas de T derivadas in vitro para o uso na medicina regenerativa e nas terapias pilha-baseadas.
Além de vantagens fisiológicas, as células T têm muitas aplicações terapêuticas potenciais. A geração e expansão das células T in vitro podem ser usadas para modelagem de doenças e validação terapêutica, bem como uma fonte de tratamento para estados de imunodeficiência hereditária e adquirida (ou seja, imunodeficiências virais e linfodepletion secundário para quimioterapia ou transplante) e para a erradicação do câncer. Esta última qualidade levou ao desenvolvimento de transferência de células T adotivas (ACT) para o tratamento de pacientes com câncer avançado1.
Act consiste em reintegrar o tumor de um paciente, extraindo linfócitos infiltrados tumorais (TILs), expandindo TILs ex vivo, em seguida, reinfundindo as células expandidas para o paciente2. Tem se mostrado uma modalidade de tratamento eficaz para alguns pacientes com câncer metastático. Infelizmente, nem todos os pacientes respondem a esta terapia. Relatórios anteriores mostraram que o estado de diferenciação das células transferidas3,4,5,6,7,8,9, uso de grandes números de células T altamente enriquecidas com antígeno de câncer10,e persistência das células T após a transferência11,12 estão todos correlacionados com respostas mais duráveis13,14. Portanto, quando act não consegue provocar uma resposta anti-tumoral, pode em parte ser devido a um baixo rendimento de células T específicas de antígeno do câncer, expansão ineficiente ex vivo levando à exaustão e perda de clones reativos, ou falta de persistência após a transferência4 . Foi postulado que esses obstáculos podem ser superados pela geração de um grande número de células T menos diferenciadas de câncer específicas de antígeno in vitro15,16.
As células-tronco/progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) são uma fonte convencional para a geração de células T in vitro, embora este método seja limitado pelo pequeno número de células capazes de ser recuperadas de um único doador1. Células-tronco embrionárias (ESCs) também foram mostrados para produzir células T, mas com baixo rendimento17, tornando-o ineficiente para aplicações clínicas. Além disso, uma vez que as células de linhagem T experimentam recombinação genética estocástica de seus receptores de células T (TCRs) em estágios iniciais de desenvolvimento, não é possível usar HSPCs ou ESCs para gerar uma população pura de células T específicas de antígeno sem mais genômica modificações como a transdução do gene TCR.
Uma abordagem para superar essas ressalvas é reprogramar TILs para células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs), que podem fornecer uma fonte ilimitada para a geração de células T in vitro. Tem sido demonstrado que os TILs específicos de antígeno do câncer podem ser reprogramados em hiPSCs e rediferenciados na linhagem de células T, que retém o mesmo rearranjo do gene do receptor de células T (TCR) que a célula T original18,19. Este detalhe é importante para act porque tumores individuais do paciente têm perfis mutational originais, e muito poucos antígenos do cancro foram mostrados para ser compartilhados entre pacientes20. Portanto, o uso de TILs específicos de antígeno do câncer como fonte para a geração in vitro de células T derivadas de hiPSC pode fornecer uma nova estratégia para o tratamento personalizado de pacientes com câncer metastático.
Apresentado aqui em detalhes é um protocolo para diferenciar células de linhagem T derivadas de hiPSC em células T cd8αβ+ únicas positivas (SP) positivas usando o sistema de cocultura OP9/DLL1. Este método é uma ferramenta poderosa para a diferenciação in vitro de células T de hiPSCs, progenitores hematopoiéticos e células-tronco embrionárias, bem como suas aplicações adicionais em medicina regenerativa e terapias baseadas em células.
A co-cultura das células estromais de urina OP9 é um sistema bem estabelecido para a geração in vitro de linfócitos (ou seja, células NK, B e T) de HSPCs e células-tronco pluripotentes. A sinalização de entalhe é necessária para induzir o compromisso de linhagem T e pode ser realizada pela expressão ectópica de Notch ligand DLL1 ou DLL4, que têm eficácia comparável para a geração de células T1. Portanto, o sistema de cocultura OP9/DLL1 tornou-se um método amplamente utilizado para a produção de células T in vitro. Além disso, este método é aplicável para uso com vários tipos e fontes de células humanas, incluindo sangue do cordão umbilical, HSPCs de medula óssea e ESCs. No entanto, a geração de células T a partir dessas fontes é limitada por recuperação insuficiente de células de origem ou por diferenciação ineficiente para as células T1. Além disso, um produto de célulaS T com uma única recombinação TCR não pode ser gerado a partir dessas fontes de repertório aberto. Usando técnicas de medicina regenerativa, ou seja, induzida stemipotente stemipotente (iPSC) tecnologia, pode ser possível produzir um grande número de células T específicas de antígeno para uso em terapêutica baseada em células15.
hiPSCs são semelhantes aos ESCs pluripotentes em sua capacidade de auto-renovação, expansão ilimitada e potencial para diferenciar qualquer tipo de célula somática no corpo; no entanto, eles não têm as preocupações éticas em torno do uso de produtos de origem embrionária para aplicações clínicas. Além disso, hiPSCs podem ser produzidos a partir de qualquer célula somática, permitindo o desenvolvimento de produtos celulares para medicina personalizada. Em relatórios anteriores, hiPSCs foram produzidos a partir de células T humanas usando células mononucleares periféricas inteiras, células CD3+ ou linfócitos citotóxicos isolados (CTLs) como fonte18,19,22, 26.Quando os hiPSCs são gerados a partir de uma fonte de células T (T-iPSCs), o rearranjo original do gene TCR é herdado. Portanto, as células T derivadas do T-iPSC paciente podem fornecer um modelo para o tratamento personalizado do ACT, visando os antígenos distintos do câncer de um paciente.
A diferenciação das células-tronco pluripotentes humanas nas células de linhagem T é dividida em duas etapas: a geração de células progenitoras hematopoiéticas (HPCs)27 e sua diferenciação adicional nas células de linhagem T21. Ambas as etapas podem ser realizadas usando o sistema de co-cultura OP9/DLL1. É importante ressaltar que a qualidade das células-alimentadorope OP9/DLL1 é fundamental para o sucesso da diferenciação de células T. Como as células OP9/DLL1 não são uma linha celular homogênea imortalizada, a qualidade da FBS e as condições culturais são fundamentais para manter sua expansão sem perder a capacidade de suportar a diferenciação de hiPSC. Portanto, recomenda-se pré-avaliar o lote de FBS e passagem consistentemente quando o contato citoplasmiccélula célula-célula começa a ocorrer, a fim de evitar a diferenciação celular e senescência. Um ponto a levar em consideração é que o contato célula-célula pode parecer indistinguível do fundo, dependendo do contraste de fase e ampliação do microscópio. Em nossa experiência, a maioria dos pratos OP9/DLL1 parecerá ser 80% de confluentes quando estiverem prontos para passar.
Tem sido demonstrado que as células de linhagem T rediferenciadas geradas a partir de T-iPSCs por OP9/DLL1 co-cultura podem produzir células T CD8+ SP após estimulação18,19. No entanto, as células T CD8+ SP regeneradas adquirem o homodimer22,28,que é um coreceptor ineficaz para a sinalização de TCR29. Além disso, essas células T CD8+ SP regeneradas têm mostrado uma citotoxicidade forte independente do TCR, tornando essas células desfavoráveis para uso clínico30. Este protocolo descreve um método recente envolvendo estimulação de células CD4+CD8+ DP purificadas purificadas purificadas para gerar células T CD8αβ+ SP com fenótipo mais convencional e citotoxicidade específica de antígeno melhorada22. Embora a perda de especificidade de antígeno devido ao rearranjo alélico TCRα secundário ocorra na fase de DP após a cultura prolongada de longo prazo, isso pode ser superado pela edição do genoma em T-iPSCs31. Em nossa experiência, as células DP derivadas de hiPSC começam a aparecer no dia 30 – 35 de cultura, e essas células DP recém-geradas ainda não foram submetidas ao rearranjo tcrα secundário. Portanto, a maioria das células DP no dia 35 retêm especificidade de antígeno e podem ser usadas para gerar células T CD8αβ+ SP específicas por antígeno.
Antes da estimulação anti-CD3 humano e anti-CD28 no dia 35, as células CD4–CD8– DN devem ser removidas da cultura, pois estas foram demonstradas para causar morte direta de células CD4+CD8+ DP após estimulação22. Usando enriquecimento de contas magnéticas CD4 (passo 3.10) enriquecerá tanto para DP quanto para CD4+CD8– células médias únicas positivas (ISP)1,que nos mostraram não ter efeitos negativos22. Alternativamente, a classificação celular ativada por fluorescência por citometria de fluxo pode ser realizada para isolar as células DP. Entretanto, a separação magnética do grânulo é preferida porque evita o esforço mecânico induzido pela citometria do fluxo.
A geração de células T CD8αβ+ SP de células-tronco pluripotentes humanas sem seleção agonista mediada pela ativação foi posteriormente demonstrada pelo uso da cultura de células estromais de urina 3D32. No entanto, a seleção fisiológica positiva depende da interação do TCR com complexos auto-peptídeos-MHC, que são exclusivamente processados e apresentados por células epiteliais cortical thymic33. Além disso, a afinidade tcr para peptídeos de seleção tem sido mostrado para determinar as capacidades funcionais subseqüentes de células T CD8αβ+ SP34. Atualmente, não há nenhuma evidência para sugerir que um sistema de co-cultura baseado em células estromals notch pode fornecer o peptídeo de seleção definida e complexo de MHC necessário para a seleção fisiológica positiva.
Tem sido relatado anteriormente em um modelo de urina que as células de linhagem T geradas a partir de hiPSCs derivados de células T específicos de antígeno tumoral usando OP9/DLL1 sozinho não conseguem experimentar maturação convencional. No entanto, células T imaturas derivadas do iPSC geradas pelo sistema OP9/DLL1 podem amadurecer em células T ingênuas por mais educação fisiológica de tímico em um sistema de cultura 3D 28,35. Portanto, o protocolo apresentado aqui para produzir células T imaturas derivadas do iPSC geradas pelo sistema OP9/DLL1 é vital para novas tentativas de gerar células T pós-ténmicas específicas de antígeno humano real capazes de persistência in vivo a longo prazo eficiência para tratar tumores vascularizados estabelecidos.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos alan B. Hoofring e Erina H. Ele para assistência gráfica. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional do Câncer (ZIA BC010763) e pela Intramural NCI Cancer Moonshot Initiative for Cell-based Cancer Immunotherapy.
10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
Anti-CD3, human | BD Biosciences | Cat# 561812, RRID:AB_1089628 | |
Anti-CD34, human | BD Biosciences | Cat# 348791, RRID:AB_400381 | |
Anti-CD4, human | Biolegend | Cat# 344612, RRID:AB_2028479 | |
Anti-CD43, human | BD Biosciences | Cat# 560198, RRID:AB_1645460 | |
Anti-CD7, human | BD Biosciences | Cat# 555361, RRID:AB_395764 | |
Anti-CD8a, human | BD Biosciences | Cat# 555369, RRID:AB_398595 | |
Anti-CD8b, human | BD Biosciences | Cat# 641057, RRID:AB_1645747 | |
Anti-TCRb, human | BD Biosciences | Cat# 555548, RRID:AB_395932 | |
CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade | Miltenyl Biotec | 130-093-375 | |
CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade | Miltenyl Biotec | 130-093-387 | |
CD4 Microbeads, human | Miltenyl Biotec | 130-045-101 | |
Cell strainer 100 um | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini | 100-500 | |
Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
Gelatin Solution 2% | SIGMA-Aldritch | G1393-100ML | |
GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine supplement |
HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free | Gibco | 14025-092 | |
Interleukin-2 | R&D Systems | 202-IL | |
Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV | MBL | Cat#TB-0009-2 | |
Mart1-hiPSC | Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013 | RIKEN-IMS | |
Melan-A, MART 1 (26-35) | InnoPep | 3146-0100 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
αMEM powder | Gibco | 61100061 | |
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Thermo Fisher Scientific | C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962 | |
OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | OP9/DLL1 |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | Human ESC Culture Media |
Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) | Tocris | 1254 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
StemPro | EZPassage | 23181-010 | |
T2-tumor | ATCC | T2 (174 x CEM.T2) (ATCC® CRL-1992™) | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
U Bottom 96 well plate | Corning, Inc. | 3799 |