JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Recherche en cancérologie

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

Published: October 24, 2019
doi:
10.3791/59997
, , , , , ,
1Surgery Branch,National Cancer Institute, NIH, 2Center for Cell-Based Therapy,National Cancer Institute, NIH, 3Laboratory of Immunology, Institute for Frontier Life and Medical Sciences,Kyoto University

Summary

Bu makalede, OP9/DLL1 co-kültür sistemini kullanarak fonksiyonel tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre türetilmiş CD8αβ+ tek pozitif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

Fonksiyonel T hücrelerinin in vitro olarak üretilip genişlemesi çok çeşitli klinik uygulamalara yol açabilir. Böyle bir kullanım ileri kanser hastalarının tedavisi içindir. Son derece zenginleştirilmiş tümör antijenspesifik T hücrelerinin benimseyen T hücre transferi (ACT) bazı hastalarda metastatik kanser ingresyon kalıcı regresyon neden olduğu gösterilmiştir. Ancak, genişleme sırasında, bu hücreler tükenmiş veya senescent olabilir, onların efektör fonksiyonu ve in vivo kalıcılığı sınırlayan. İndüklenen pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisi daha az diferansiye tümör antijenspesifik T hücrelerinin çok sayıda in vitro nesil yol ederek bu engelleri aşabilir. İnsan iPSC (hiPSC) bir T hücresi başlangıç hücresi olarak kullanıldığında orijinal T hücre reseptörü (TCR) genomik yeniden düzenlenmesi korumak lenfositler de dahil olmak üzere somatik hücre, her türlü ayırt etme kapasitesine sahiptir. Bu nedenle, insan tümör antijen-spesifik T hücrelerinin hiPSC’ye yeniden programlanması ve ardından T hücre siline redifferentiation gençleşmiş tümör antijen-spesifik T hücreleri üretme potansiyeline sahiptir. Burada açıklanan OP9/DLL1 co-kültür sistemi kullanarak hiPSC tümör antijene özgü CD8αβ+ tek pozitif (SP) T hücreleri üretmek için bir yöntemdir. Bu yöntem in vitro T hücre soyu üretimi için güçlü bir araçtır ve rejeneratif tıp ve hücre bazlı tedavilerde kullanılmak üzere in vitro türetilmiş T hücrelerinin gelişimini kolaylaştıracaktır.

Introduction

Fizyolojik avantajlara ek olarak, T hücreleri birçok potansiyel terapötik uygulamalara sahiptir. T hücrelerinin in vitro üretimi ve genişlemesi hastalık modellemesi ve terapötik doğrulamanın yanı sıra kalıtsal ve edinsel immün yetmezlik durumları için bir tedavi kaynağı (örn. viral immün yetmezlikler ve sekonder lenfodeplesyon kemoterapi veya transplantasyon) ve kanserin ortadan kaldırılması için. Bu ikinci kalite ileri kanser hastalarının tedavisi için benimseyen T hücre transferi (ACT) gelişimine yol açmıştır1.

ACT bir hastanın tümör rezeksiyon oluşur, tümör infiltrasyon lenfositler ayıklama (TILs), TILs ex vivo genişletilmesi, daha sonra hasta içine genişletilmiş hücreleri reinfüzyon2. Metastatik kanserli bazı hastalarda etkili bir tedavi yöntemi olduğu gösterilmiştir.  Ne yazık ki, tüm hastalar bu tedaviye yanıt. Önceki raporlar, aktarılan hücrelerin farklılaşma durumunun3,4,5,6,7,8,9, büyük sayıların kullanımı olduğunu göstermiştir son derece zenginleştirilmiş kanser antijen-spesifik T hücreleri10, ve transfer sonra T hücrelerinin kalıcılığı11,12 tüm daha dayanıklı tepkiler ile ilişkilidir13,14. Bu nedenle, ACT bir anti-tümör yanıtı ortaya çıkarmak için başarısız olduğunda, kısmen kanser antijene özgü T hücrelerinin düşük verim nedeniyle olabilir, verimsiz ex vivo genişleme yorgunluk ve reaktif klonların kaybına yol açan, ya da transfer sonra kalıcılık eksikliği4 . Bu engellerin daha az diferansiye kanser antijenspesifik T hücrelerinin çok sayıda nesil tarafından aşılanabileceği ileri sürülmuştur15,16.

Hematopoetik kök /progenitor hücreleri (HSPCs) in vitro T hücre üretimi için geleneksel bir kaynaktır, bu yöntem tek bir donörden kurtarılabilir hücrelerin az sayıda ile sınırlı olmasına rağmen1. Embriyonik kök hücreler (ESCs) da T hücreleri üretmek için gösterilmiştir ama düşük verimile 17, klinik uygulamalar için verimsiz hale. Ayrıca, T soyu hücreleri erken gelişim evrelerinde T hücre reseptörlerinin (TÇR) stoksetik genetik rekombinasyonunu deneyimlediğinden, daha fazla genomik olmayan saf bir antijene özgü T hücresi popülasyonu oluşturmak için HSPC veya ESC kullanmak mümkün değildir. TCR gen transdüksiyonu gibi modifikasyonlar.

Bu uyarılar üstesinden gelmek için bir yaklaşım in vitro T hücre üretimi için sınırsız bir kaynak sağlayabilir insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere (hiPSCs), TILs yeniden programlamaktır. Bu kanser antijene özgü TILs hiPSCs içine yeniden programlanmış ve orijinal T hücre li 18 olarak aynı T hücre reseptörü (TCR) gen rearrangement korur T hücre soyuna yeniden ayırt gösterilmiştir ,19.  Bireysel hasta tümörleri benzersiz mutasyona sahip çünkü bu ayrıntı ACT için önemlidir, ve çok az kanser antijenleri hastalar arasında paylaşıldığı gösterilmiştir20. Bu nedenle, hiPSC türetilmiş T hücrelerinin in vitro nesil için bir kaynak olarak kanser antijene özgü TILs kullanarak metastatik kanserli hastaların kişiselleştirilmiş tedavisi için yeni bir strateji sağlayabilir.

Burada ayrıntılı olarak sunulan op9/DLL1 co-kültür sistemi kullanarak fonksiyonel antijene özgü CD8αβ+ tek pozitif (SP) T hücrelerine hiPSC türetilmiş T soy hücrelerini ayırt etmek için bir protokoldür. Bu yöntem hiPSCs in vitro T hücre farklılaşması için güçlü bir araçtır, hematopoetik ataları, ve embriyonik kök hücreler, yanı sıra rejeneratif tıp ve hücre tabanlı tedaviler de diğer uygulamalar.

Protocol

1. Fare Embriyonik Fibroblastlar (MEF) üzerinde Culturing İnsan iPSCs (hiPSCs) NOT: HiPSC’leri kültüre almak için alternatif yöntemler de kullanılabilir, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere: jelatin, jelatinimsi protein karışımı, rekombinant laminin 511 veya hiPSC genişlemesinde kullanılan diğer ekstrasellüler matriks ile önceden kaplanmış 6 kuyuluk plakaüzerine tohumlama ve insan pluripotent kök hücre kültürü için özel olarak formüle edilmiş tanımlanmış medya kullanılarak kültürlenmiş. MeF’i üçme Kat 10 cm hücre kültürü Petri çanak 4 mL ile 0.1% jelatin ve kuluçka için 30 dakika 37 °C. 4 x 106 ışınlanmış mef şişesini hızlıca 37 °C MEF media ‘nın 10 mL’sine (DMEM + FBS + 1x penisilin-streptomisin + 1x L-glutamin takviyesi) eritin. Santrifüj 300 x g için 5 dk 4 °C’de. Supernatant aspire ve MEF medya 9 mL hücre pelet resuspend. Jelatin kaplı tabağı kuvözden çıkarın. Aspire jelatin ve MEF medya 7 mL ekleyin. Jelatin kaplı tabağa 3 mL MEF süspansiyon (adım 1.1.2’den) geçirgen kaplamalı tabağa. Çanak üzerinde MEF eşit dağılımını sağlamak için çanak yan yana ve önden arkaya kaya. 37 °C’de 8-36 saat kuluçkaya yatırın. MEF’de hiPSC’yi paslamaNOT: Veriler, daha önce18olarak açıklandığı gibi, HLA-A*02:01 bağlamında mart-1 peptidini özellikle tanıyan uzun vadeli kültürlü melanom TIL’den elde edilen MART-1 iPSC kullanılarak oluşturulmuştur. Koloniler çapı 0,8 – 1,2 mm arasında olduğunda geçit hiPSCs. Geçişten önce, stereo-mikroskoptaki hiPSC kolonilerini kontrol edin ve 200 μL’lik bir ucun plastik kenarını kullanarak kültürden farklılaşma alanlarını kaldırın. Aspire harcanan ortam ve 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenen 10 mL hiPSC ortam (insan ES kültür ortamı [Malzeme Tablosu] + 10 ng/mL insan temel fibroblast büyüme faktörü [hbFGF]) ekleyin. Hücre kültürü çanağını bir elinizde tutun ve tek kullanımlık bir hücre geçiş aracını tek bir yönde tüm çanak boyunca yuvarlayın. Tüm silindir bıçağın kültür kabına dokunur ve yuvarlanma hareketi sırasında tek tip basıncı koruyacak kadar yeterli basıncı uygulayın. Kültür çanasını 90° döndürün ve 1.2.3 adımını tekrarlayın. Kontrolde görünmesi gereken kolonilerin düzgün kesilmesini görsel olarak doğrulamak için mikroskoptaki plakayı görüntüleyin. 200 μL’lik pipet kullanarak kolonileri nazik mekanik yıkama ile ayırın.NOT: Mekanik yıkama ile kesilmiş kolonilerin ayrılması rulo ile koloniler kesildikten hemen sonra yapılmalıdır, çünkü 3 dakika sonra kesilmiş koloniler çanak yeniden takmaya başlayacak, ve yıkama ile homojen büyüklükte koloniler ayırmak zor olacak. 10 mL taze hiPSC ortam 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenen MEF (kaplama 8 – 36 saat önce) yeni bir 10 cm çanak üzerine kesilmiş koloniler 600 kümeleri aktarın. 37 °C’de kuluçkaya yatırın.NOT: 600 kümeler yaklaşık 1.0 x 106 MART-1 iPSC temsil eder ve 35. Ancak, beklenen sayılar başlangıç hücre hattı ve kültür koşullarının gücüne bağlı olarak değişir. Ertesi gün, aspire harcanan medya ve taze hiPSC medya 10 mL ekleyin. HiPSC büyüme hızına bağlı olarak hiPSC ortamını her 1-2 günde bir değiştirin. 2. HIPSC’lerle Birlikte Kültür için OP9/DLL1 Hücrelerinin Hazırlanması OP9 media’da Kültür OP9/DLL1 hücreleri [α-minimum esansiyel orta (α-MEM) + fetal sığır serumu (FBS) + 1x penisilin-streptomisin] 37 °C’de. OP9/DLL1 hücreleri biraraya geldiğinde, aspire ortamı ve 1x magnezyum, kalsiyum ve fenol kırmızı içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) 5 mL ile bir kez yıkayın. PBS aspire edin ve %0,05 Tripsin-EDTA 2 mL ekleyin.  37 °C’de 5 dk kuluçka. Daha sonra, 4 mL OP9 ortam ekleyin ve tek hücreli süspansiyon yapmak için pipetleme yaparak hücre tabakasını mekanik olarak ayrıştırın. Hücre kümelenmelerini önlemek için hücre süspansiyonunun 100 μm’lik bir süzgeçten 50 mL konik bir tüpe aktarılması. Santrifüj 300 x g için 5 dk 4 °C’de. OP9 medyasının 12 mL’sinde süpernatantı aspire edin ve yeniden askıya alın. Altı yeni 10 cm hücre kültürü Petri yemeklerinin her birine 8 mL OP9 ortam ekleyin. Her yeni 10 cm çanak üzerine adım 2.3 OP9/DLL1 hücre süspansiyon Plaka 2 mL. Çanak üzerinde OP9/DLL1 eşit dağılımını sağlamak için çanak yan yana sonra önden arkaya kaya. 37 °C’de kuluçkaya yatırın. Hücreler birleştiğinde her 2 -3 günde bir geçişi tekrarlayın.NOT: Op9/DLL1 hücrelerinin yeterli dondurulmuş stok yapmak ve her 4-6 haftada yeni bir stok çözülmek önemlidir. 3. HiPSC’lerin CD8αβ+ Tek Pozitif (SP) T Hücrelerine Vitro Farklılaşması HiPSC’lerle ortak kültürden bir hafta önce jelatinize OP9/DLL1 yemekleri hazırlayın. %0,1 jelatin çözeltisi hazırlamak için 500 mL PBS’ye oda sıcaklığında 5 mL (RT) doku sınıfı stok jelatin çözeltisi ekleyin. Coat 3 yeni 10 cm hücre kültürü Petri yemekleri% 0.1 jelatin çanak başına 4 mL ekleyerek.  37 °C’de kuluçka 30 dk. Jelatin aspire edin ve her çanağa 8 mL OP9 ortam ekleyin. Op9/DLL1 passage bir confluent çanak (yukarıdaki bölüm 2’de yapıldığı gibi) üç jelatin önceden kaplanmış yemekler. 4 gün sonra, her bir çanak başına toplam 20 mL ortam için jelatin üzerine op9/DLL1’in her 10 cm’lik yemeğine 10 mL OP9 ortam ekleyin. 7 – 8 gün sonra, OP9/DLL1 uyumlu yemekler (farklılaşma gün 0) üzerinde hiPSC co-kültür başlar. Aspire MEF üzerinde hiPSCs confluent 10 cm çanak medya harcanan. 10 mL OP9 ortam ekleyin. 1.2.3 ve 1.2.4 adımlarında yapıldığı gibi tek kullanımlık hücre geçiş aracı kullanarak hiPSC kolonilerini kesip ayırın. 200 μL’lik pipet kullanarak 10 mL taze OP9 media ile 10 cm önceden jelatinize edilmiş OP9/DLL1 çanağı (adım 3.1) üzerine 350 – 600 küme kesilmiş kolonileri aktarın. Kolonilerin eşit dağılımını sağlamak için kültür çanağı yan yana sonra önden arkaya rock.NOT: Alternatif olarak, önceden oluşturulmuş hiPSC embriyoid cisimler (EBs) veya küçük küme süspansiyon kullanılabilir.  Ancak tek tip boyutta hiPSC kümeleri üretmek için tek kullanımlık hücre geçiş aracı veya EB oluşum sistemi kullanımı tercih edilir. 1. günde, aspire medya harcanan ve taze OP9 medya 20 mL ile değiştirin. 1 gün boyunca OP9/DLL1’de birlikte kültürlenmiş hiPSC kümeleri küçük yuvarlak tek katmanlı koloniler olarak görünür (Şekil 1). 5. günde, harcanan 10 mL’lik ortamı aspire edin ve 10 mL taze OP9 ortam ekleyin. hiPSC kolonileri çok katmanlı karanlık merkezi ile karakterize ilkel mezoderm, farklılaşmaya başlayacaktır. 9. günde, harcanan 10 mL’lik ortamı aspire edin ve 10 mL taze OP9 ortam ekleyin. Bu noktada, çok katmanlı merkez yapıları kubbe benzeri şekillere dönüşecek ve çevresel ağ benzeri bir alan belirginleşmeye başlayacaktır. 13. günde hematopoetik ata hücreleri (HPC) hasat edilir (Şekil 1). 13. günde hiPSC kaynaklı yapılar, daha önce insan embriyonik kök hücre kaynaklı hematopoetik ataları içine bildirilen hematopoetik bölgeleri (HZs) temsilcisi, kubbe benzeri alanlardan oluşan bir ağ ile çevrili koyu bir merkezi organoid ile karakterizedir. 21. yıl.NOT: Kubbe benzeri yapıların varlığı, karanlık merkezlerin yokluğunda bile başarılı bir sürecin olduğunu gösterir. HPC’lerin üretilememesi, OP9/DLL1 kalitesinin düşük olması, FBS lotunun kalitesi, OP9/DLL1 üzerine tohumlanmış iPSC kümelerinin biraraya gelmesi (350-600 kümeler en uygun) ve/veya hematopoetik öncülleri üretmek için iPSC hatlarının potensinalindeki farklılıklardan kaynaklanıyor olabilir. Aspire medya harcanan ve 1x 1x 1x 1x fenol kırmızı içermeyen Hanks ‘dengeli tuz çözeltisi kalsiyum ve magnezyum (HBSS) ile modifiye. HBSS’yi aspire edin ve 10 mL HBSS’ye 250°L 5000 Adet/mL kollajenaz IV ekleyin. 37 °C’de 45 dk. Aspire HBSS kollajenaz IV ile inkübatın ve 5 mL PBS ile bir kez yıkayın. PBS aspire edin ve %0,25 Tripsin-EDTA 5 mL ekleyin. 37 °C’de 20 dk kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 4 mL OP9 ortam ekleyin ve tek hücreli süspansiyon yapmak için pipetleme ile hücre tabakasını ayırın. Hücre süspansiyonuna 100 μm’lik bir süzgeçten 50 mL konik bir tüpe aktarın.  Santrifüj 300 x g için 5 dk 4 °C’de. OP9 ortamının 10 mL’sinde süpernatant’ı aspire edin ve yeniden askıya alın. Yeni bir jelatinize 10 cm hücre kültürü Petri çanak üzerine plaka hücre süspansiyon (adımlar 3.1.1 ve 3.1.2 bakınız). 37 °C’de 45 dk kuluçkaya yatırın. Daha sonra, nazik pipetleme ile non-yapışık hücreleri toplamak. Toplanan hücre süspansiyonunun 100 μm’lik bir süzgeç aracılığıyla 50 mL konik bir tüpe aktarılması.  Santrifüj 300 x g için 5 dk 4 °C’de. 10 mL’lik farklılaşma ortamı [OP9 media 5 ng/mL insan kök hücre faktörü (hSCF), 5 ng/mL insan Flt3 ligand (hFLT3L) ve 5 ng/mL insan interlökin 7 (hIL-7)] ile aspire edin. Hücre süspansiyonuna yeni 10 cm OP9/DLL1 konfluent bir çanak üzerine plaka koyun. 16. günde hücreleri geç. Mekanik olarak yapışmayan hücreleri nazik pipetleme ile ayırın ve 100 μm hücreli süzgeçten filtreleyin. Santrifüj 300 x g için 5 dk 4 °C’de. Supernatant aspire ve 10 mL farklılaştırma medyarematasyon. Hücre süspansiyonuna yeni 10 cm OP9/DLL1 konfluent bir çanak üzerine plaka koyun. Daha sonra her 5-7 günde bir 3.8 adımı tekrarlayarak yapışık olmayan hücreleri geçirmeye devam edin. 35. günde, CD4+CD8+ çift pozitif (DP) popülasyonu zenginleştirir ve CD8αβ+ SP T hücreleri üretmek için teşvik edin (Şekil 2). Mekanik olarak yapışmayan hücreleri nazik pipetleme ile ayırın ve hücre kümelerini temizlemek için 100 μm’lik bir hücre süzgecinden geçirin. CD4+ hücre popülasyonu CD4 manyetik boncuk izolasyonu ile üreticinin protokolüne göre zenginleştirin.NOT: CD4 manyetik boncuklar kullanarak mantığı CD4 kaldırmaktır-CD8- DN hücreleri kültürden, bu uyarılma22sonra CD4+CD8+ DP hücrelerinin doğrudan öldürülmesine neden olduğu gösterilmiştir . Neubauer hemositometre ve Trypan mavi boya kullanarak canlı CD4 zenginleştirilmiş hücreleri sayın.  OP9 ortamda toplam konsantrasyonda 0,5 x 106 hücre/mL askıya alın. Aliquot 1 mL hücre süspansiyon (0.5 x 106 hücreleri) bir doku kültürü düz alt 24 iyi plaka confluent OP9/DLL1 her kuyuiçine. 100 IU insan interlökin 2 (hIL-2), 5 ng/mL hIL-7, 500 ng/mL anti-insan CD3 antikor ve 2 μg/mL anti-insan CD28 antikor, sonra kültür 37 °C ekleyin. Stimülasyondan sonra 4 – 7. 4. HiPSC Türetilmiş CD8αβ+ SP T Hücrelerinin Antijen Özgüllüğünün Ölçülmesi NOT: Bu ekspertiz için kullanılacak ADC türü hiPSC türetilmiş T hücrelerinin MHC kısıtlamasına bağlıdır. Burada, T2 hücre hattı kullanılır, Hangi T ve B lenfoblastoid hücre hatlarının bir melez. T2 hücreleri HLA-A*02:0123ifade , HANGI MART1-iPSC türetilmiştir JKF6 hücreleri tarafından tanınan18. Bu T2 hücre hattı RPMI 1640 + FBS + 1x penisilin-streptomisin olarak genişletilebilir ve hücreler 5 x 105 hücre/mL yoğunluğa ulaştığında geçiş yapılır. Canlı HLA-A*02:01+ T-B hibrid lenfoblastoid T2 hücrelerini Neubauer hemositometre ve Trypan mavi boya kullanarak sayın. 37 °C’de 2 saat boyunca 1 μg/mL MART-1 peptid ile 24 kuyu doku kültür plakası içinde kuluçka APC’leri.NOT: Optimal peptit konsantrasyonu değişkendir, hücre hattı ve antijen özgüllüğü ne bağlı olarak. ADC’leri toplayın ve ekstra peptidleri çıkarmak için 10 mL PBS ile 2 kat yıkayın. 100 IU IL-2 ve 5 ng/mL IL-7 ile OP9 ortamlarında 2 – 5 x 105 hücre/mL’de ADC’leri sayın ve askıya alın. Aliquot 100 μL hücre süspansiyonu (2-5 x 104 hücre) ultra düşük eki U alt 96 iyi plaka veya doğrudan önceden kaplanmış ELISpot plaka içine her kuyuiçine. HiPSC türetilmiş CD8αβ+ SP T hücrelerini (insan karşıtı CD3/CD28 antikor stimülasyonundan 1 hafta sonra) bir hücre ayırıcısı kullanarak sıralayın ve OP9 ortamlarında 1x 106 hücre/mL’de 100 IU IL-2 ve 5 ng/mL IL-7 ile askıya alın. Aliquot 100 μL hücre süspansiyonu (1 x 105 hücre) her bir kuyuya ait aparatlara ve kültüre 16 – 20 saat 37 °C’de. 16 – 20 saat sonra, üreticiprotokolüne göre ELISpot tsay ile sitokin salgı profilini analiz edin(Şekil 4).

Representative Results

OP9/DLL1 ile birlikte 13 gün hiPSCs sonra, CD34+CD43+ hematopoetik progenitor hücreleri ortaya çıktı (Şekil 1). HSCF, hFLT3L ve hIL-7 varlığında jelatinize olmayan OP9/DLL1 üzerinde ek bir kültür 22 gün sonra, hematopoetik atalar CD3+CD7+CD4 + CD8+çift pozitif (DP) Tage hücreleri, farklılaşmış çoğunluğu MART-1 epitopuna özgü TCR’yi ifade eder (tetramer) (Şekil 2). Daha önce CD8+ SP T hücrelerinin CD4+CD8+ DP T hücrelerinden agonist peptid veya antikor güdümlü TCR stimülasyonu 24,25ile TCR sinyali ile indüklenebildiği gösterilmiştir. Bu nedenle, kültür 35 gün, hiPSC türetilmiş CD4+CD8+ DP T hücreleri hIL-7 ve hIL-2 varlığında anti-insan CD3 ve anti-insan CD28 antikorları ile uyarıldı.  Stimülasyondan dört gün sonra, CD3+CD8αβ+ SP hücrelerinin sayısı önemli ölçüde artmış ve MART-1 epitopiçin spesifik kalarak kalıtsal antijen özgüllüklerinin korunmasını doğrular(Şekil 3). HiPSC türetilmiş CD8αβ+ SP T hücrelerinin fonksiyonel özelliklerini belirlemek için antijene bağımlı aktivasyon ve interferon gama salgıları (IFN-γ) analiz edildi. 1 hafta boyunca anti-insan CD3 ve anti-insan CD28 antikorları ile uyarılmasından sonra, hiPSC kaynaklı CD8αβ+ SP T hücreleri bir hücre ayırıcı kullanılarak izole edildi ve HLA-A*02:01 ile veya 16 için cognate MART1 peptid olmadan ifade T2 hücre hattı ile birlikte kültürlü 16 – 20 saat. ELISpot test, HIPSC kaynaklı CD8αβ+ SP T hücrelerinin MART-1 peptid varlığında kültürlendiğinde CD8αα+ SP T hücrelerine kıyasla daha yüksek miktarda IFN-γ salgıladığını ortaya koymuştur. IFN-γ ekspresyonu sadece T hücreleri ve AAP’ler için null olarak, insan T-iPSC kaynaklı T hücrelerinin antijene özgü ve işlevsel olduğunu göstermektedir(Şekil 4). Şekil 1: HiPSC kaynaklı hematopoetik progenitor hücrelerinin üretimi. (A) OP9/DLL1 co-culture kullanarak hiPSC’lerin hematopoetik soya farklılaşmasının şematik genel bakışı. (B) HiPSC’den türetilmiş yapıların 1 (sol üstte), 3 (sağ üstte), 7 (sol altta) ve 13 (sağ altta) görünümü. Ölçek çubukları = 100 μm. (C) 13. Veriler altı bağımsız deneyi temsil eder (n = 1 – 2). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Mart1 + CD4+ CD8αβ+ DP T hücrelerine hiPSC farklılaşması. (A) OP9/DLL1 co-culture kullanarak hiPSC kaynaklı hematopoetik soyundan immatür T hücrelerine farklılaşması şeması. (B) 35. günde HIPSC türetilmiş T hücrelerinde CD4 ile CD8α, CD3 vs. CD8β ve MART-1 tetramer ekspresyonunun akış sitometrik analizi. Lenfositler, tek hücreler, PI negatif. Veriler üç bağımsız deneyi temsil eder (n = 3 – 8). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: CD8αβ+ SP T hücre fenotipinin indüksiyonu. CD4 Akış sitometrik analizi- hiPSC türetilmiş T hücreleri 4 gün sonra insan anti-CD3 ve insan anti-CD28 antikor güdümlü stimülasyon. Lenfositler, tek hücreler, PI negatif (n = 4) üzerinde kapılı.   Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: HiPSC türetilmiş CD8αβ+ SP T hücrelerininantijen özgüllüğü. ELISpot’un hiPSC kaynaklı CD8αβ+ SP, CD8αα+ SP ve 20 saat ortak kültürden sonra yapılan toplu T hücrelerinin IFN-γ salgısı MART-1 peptid ile darbeli (veya değil) T2 hücreleri ile. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

OP9 murine stromal hücrelerinin ortak kültürü, HSPC’lerden ve pluripotent kök hücrelerden in vitro lenfosit (yani NK, B ve T hücreleri) için iyi kurulmuş bir sistemdir. Çentik sinyalizasyon T soy taahhüdü ikna etmek için gerekli olan ve T hücreüretimiiçin karşılaştırılabilir etkinliği var Notch ligand DLL1 veya DLL4, ektopik ifade ile gerçekleştirilebilir 1 . Bu nedenle, OP9/DLL1 co-kültür sistemi in vitro T hücreleri üretmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir.  Ayrıca, bu yöntem kordon kanı, kemik iliği HSPCs ve ESCs de dahil olmak üzere insan hücrelerinin çeşitli türleri ve kaynakları ile kullanım için geçerlidir.  Ancak, bu kaynaklardan T hücrelerinin üretimi ya kaynak hücrelerin yetersiz alınması ya da T hücrelerinin verimsiz farklılaşması ile sınırlıdır1. Ayrıca, bu açık reperton kaynaklarından tek bir TCR rekombinasyonlu bir T hücre ürünü oluşturulamaz. Rejeneratif tıp teknikleri kullanarak, yani indüklenen pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisi, hücre tabanlı terapötik lerde kullanılmak üzere antijene özgü T hücrelerinin büyük sayılar üretmek mümkün olabilir15.

hiPSC’ler kendi kendini yenileme, sınırsız genişleme ve vücuttaki her türlü somatik hücreyi ayırt etme potansiyeline sahip pluripotent ESC’lere benzerler; ancak, klinik uygulamalar için embriyonik kökenli ürünlerin kullanımı çevreleyen etik kaygıları eksikliği. Ayrıca, hiPSCs kişiselleştirilmiş tıp için hücre ürünlerinin geliştirilmesine izin, herhangi bir somatik hücreden üretilebilir. Önceki raporlarda, hiPSCs insan T hücrelerinden tüm periferik mononükleer hücreler, CD3+ hücreleri veya izole sitotoksik T lenfositler (CTLs) bir kaynak olarak18,19,22kullanılarak üretilmiştir, 26– HiPSC’ler Bir T hücre kaynağından (T-iPSCs) oluşturulduğunda, orijinal TCR gen düzenlemesi kalıtsaldır. Bu nedenle, hasta T-iPSC türetilmiş T hücreleri bir hastanın farklı kanser antijenleri hedefleyerek kişiselleştirilmiş ACT tedavisi için bir model sağlayabilir.

T soy hücrelerine insan pluripotent kök hücrelerinin farklılaşması iki adıma ayrılır: hematopoetik ata hücrelerinin üretimi (HPCs)27 ve T soy hücrelerine daha fazla farklılaşma21. Her iki adım da OP9/DLL1 ortak kültür sistemi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Daha da önemlisi, OP9/DLL1 besleyici hücrelerinin kalitesi T hücre farklılaşmasının başarısı için çok önemlidir. OP9/DLL1 hücreleri ölümsüzleştirilmiş homojen bir hücre hattı olmadığından, FBS kalitesi ve kültür koşulları hiPSC farklılaşmasını destekleme yeteneğini kaybetmeden genişlemelerini sürdürmek için çok önemlidir. Bu nedenle, hücre farklılaşmasını ve yaşlanmayı önlemek için hücreden hücreye sitoplazmik temas oluşmaya başladığında FBS ve geçiş in çok önceden değerlendirilmesi tavsiye edilir. Dikkate alınması gereken bir nokta hücre-hücre teması faz kontrast ve mikroskop büyütme bağlı olarak arka plan dan ayırt edilemez görünebilir. Deneyimlerimize göre, op9/DLL1 yemeklerinin çoğu geçişe hazır olduğunda %80’i konakıcı görünecektir.

OP9/DLL1 eş-kültür tarafından T-iPSCs oluşturulan refarklıleştirilmiş T soy hücreleri stimülasyon üzerine CD8+ SP T hücreleri üretebilir gösterilmiştir18,19. Ancak, rejenere CD8+ SP T hücreleri doğuştan cd8αα homodimer22elde,28, TCR sinyal için etkisiz bir co-reseptör29.  Ayrıca, bu rejenere CD8+ SP T hücreleri güçlü TCR-bağımsız sitotoksisite göstermiştir, klinik kullanım için bu hücreleri olumsuz hale30. Bu protokol, daha geleneksel fenotip ve geliştirilmiş antijene özgü sitotoksisite ile CD8αβ+ SP T hücreleri oluşturmak için saflaştırılmış CD4+CD8+ DP hücrelerinin uyarılmasını içeren yeni bir yöntem açıklar22. Sekonder TCRα allelik yeniden düzenlenmesinedeniyle antijen özgüllüğü kaybı uzun süreli kültürden sonra DP aşamasında meydana gelmesine rağmen, bu T-iPSCs genom düzenleme ile aşılabilir31.  Deneyimlerimize göre, hiPSC kaynaklı DP hücreleri kültürün 30 – 35. Bu nedenle, gün 35 dp hücrelerinin çoğu antijen özgüllüğünü korumak ve antijene özgü CD8αβ+ SP T hücreleri oluşturmak için kullanılabilir.

Önce insan anti-CD3 ve anti-CD28 stimülasyon gün 35, CD4–CD8– DN hücreleri kültürden kaldırılmalıdır, bu uyarılma sonra CD4+CD8+ DP hücrelerinin doğrudan öldürülmesine neden olduğu gösterilmiştir22. CD4 manyetik boncuk zenginleştirme (adım 3.10) kullanarak dp ve CD4+CD8 için zenginleştirecek– ara tek pozitif (ISS) hücreleri1, biz hiçbir olumsuz etkisi olduğu gösterilmiştir22. Alternatif olarak, akış sitometrisi ile floresan aktive hücre sıralama DP hücreleri izole etmek için yapılabilir. Ancak akış sitometrisinin neden olduğu mekanik stresi önlediği için manyetik boncuk ayrıştırımı tercih edilir.

Aktivasyon aracılı agonist seçimi olmadan insan pluripotent kök hücrelerinden CD8αβ+ SP T hücrelerinin üretimi daha sonra 3D murine stromal hücre kültürü kullanımı ile gösterilmiştir32. Ancak, fizyolojik pozitif seçilim, tcr’nin kendi kendine peptid-MHC kompleksleri ile etkileşimine bağlıdır, bu kompleksler tarafından benzersiz bir şekilde işlenir ve timik kortikal epitel hücreleri tarafından sunulur33. Ayrıca, olgun CD8αβ+ SP T hücrelerinin sonraki fonksiyonel yeteneklerini belirlemek için tcr afinitesi gösterilmiştir34.  Şu anda, bir Notch stromal hücre tabanlı co-kültür sistemi fizyolojik pozitif seçim için gerekli tanımlanmış seçim peptid ve MHC kompleksi sağlayabilir önermek için hiçbir kanıt yoktur.

Daha önce bir murine modelinde tümör antijene özgü T hücre türetilmiş hiPSC’lerden üretilen T soy hücrelerinin tek başına OP9/DLL1 kullanılarak konvansiyonel olgunlaşma deneyimi nin başarısız olduğu bildirilmiştir. Ancak, OP9/DLL1 sistemi tarafından oluşturulan iPSC kaynaklı olgunlaşmamış T hücreleri 3D kültür sisteminde daha fazla fizyolojik timik eğitim ile naif gibi T hücrelerine olgunolabilir 28,35. Bu nedenle, OP9/DLL1 sistemi tarafından oluşturulan iPSC türetilmiş olgunlaşmamış T hücreleri üretmek için burada sunulan protokol, gerçek insan tümör antijen-spesifik post-timik T hücreleri in vivo uzun vadeli kalıcılık yeteneğine oluşturmak için daha fazla girişim için hayati önem taşımaktadır kurulan vaskülarize tümörlerin tedavisinde verimlilik.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Alan B. Hoofring ve Erina H.’ye teşekkür ederiz. O grafik yardım için. Bu araştırma, Ulusal Kanser Enstitüsü (ZIA BC010763) Intramural Araştırma Programı ve Hücre Tabanlı Kanser İmmünoterapisi için Intramural NCI Kanser Moonshot Girişimi tarafından desteklenmiştir.

Materials

10 cm dish Corning, Inc.  353003
Anti-CD3, human BD Biosciences Cat# 561812, RRID:AB_1089628
Anti-CD34, human BD Biosciences Cat# 348791, RRID:AB_400381
Anti-CD4, human Biolegend Cat# 344612, RRID:AB_2028479
Anti-CD43, human BD Biosciences Cat# 560198, RRID:AB_1645460
Anti-CD7, human BD Biosciences Cat# 555361, RRID:AB_395764
Anti-CD8a, human BD Biosciences Cat# 555369, RRID:AB_398595
Anti-CD8b, human BD Biosciences Cat# 641057, RRID:AB_1645747
Anti-TCRb, human BD Biosciences Cat# 555548, RRID:AB_395932
CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade Miltenyl Biotec 130-093-375
CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade Miltenyl Biotec 130-093-387
CD4 Microbeads, human Miltenyl Biotec 130-045-101
Cell strainer 100 um Fisher Scientific 22-363-549
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini 100-500
Flt-3 ligand R&D Systems 427-FL
Gelatin Solution 2%  SIGMA-Aldritch G1393-100ML
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061 L-Glutamine supplement
HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free Gibco 14025-092
Interleukin-2 R&D Systems 202-IL
Interleukin-7 R&D Systems 407-ML
iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV MBL Cat#TB-0009-2
Mart1-hiPSC Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013 RIKEN-IMS
Melan-A, MART 1 (26-35) InnoPep 3146-0100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
αMEM powder Gibco 61100061
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Thermo Fisher Scientific C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962
OP9/N-DLL1 Riken Bioresource center Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 OP9/DLL1
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) Thermo Fisher Scientific 10010-023
Primate ES Cell Medium Reprocell RCHEMD001 Human ESC Culture Media
Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) Tocris 1254
RPMI 1640 Gibco 11875093
Stem Cell Factor (SCF) R&D Systems 455-MC
StemPro EZPassage 23181-010
T2-tumor ATCC T2 (174 x CEM.T2) (ATCC® CRL-1992™) 
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-062
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25200-072
U Bottom 96 well plate Corning, Inc.  3799
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est. Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).
  2. Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science. 348 (6230), 62-68 (2015).
  3. Gattinoni, L., et al. Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells. Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).
  4. Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
  5. Crompton, J. G., et al. Lineage relationship of CD8(+) T cell subsets is revealed by progressive changes in the epigenetic landscape. Cellular and Molecular Immunology. 13 (4), 502-513 (2016).
  6. Henning, A. N., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. Silencing stemness in T cell differentiation. Science. 359 (6372), 163-164 (2018).
  7. Henning, A. N., Roychoudhuri, R., Restifo, N. P. Epigenetic control of CD8(+) T cell differentiation. Nature Reviews Immunology. 18 (5), 340-356 (2018).
  8. Vodnala, S. K., et al. T cell stemness and dysfunction in tumors are triggered by a common mechanism. Science. 363 (6434), (2019).
  9. Restifo, N. P., Gattinoni, L. Lineage relationship of effector and memory T cells. Current Opinion in Immunology. 25 (5), 556-563 (2013).
  10. Tran, E., et al. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer. Science. 344 (6184), 641-645 (2014).
  11. Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
  12. Gautam, S., et al. The transcription factor c-Myb regulates CD8(+) T cell stemness and antitumor immunity. Nature Immunology. 20 (3), 337-349 (2019).
  13. Klebanoff, C. A., et al. Determinants of successful CD8+ T-cell adoptive immunotherapy for large established tumors in mice. Clinical Cancer Research. 17 (16), 5343-5352 (2011).
  14. Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. Sorting through subsets: which T-cell populations mediate highly effective adoptive immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).
  15. Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. Reprogramming antitumor immunity. Trends in Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).
  16. Crompton, J. G., Rao, M., Restifo, N. P. Memoirs of a reincarnated T cell. Cell Stem Cell. 12 (1), 6-8 (2013).
  17. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  18. Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
  19. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
  20. Lo, W., et al. Immunologic recognition of a shared p53 mutated neoantigen in a patient with metastatic colorectal cancer. Cancer Immunology Research. , (2019).
  21. Timmermans, F., et al. Generation of T cells from human embryonic stem cell-derived hematopoietic zones. Journal of Immunology. 182 (11), 6879-6888 (2009).
  22. Maeda, T., et al. Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity. Recherche en cancérologie. 76 (23), 6839-6850 (2016).
  23. Salter, R. D., Howell, D. N., Cresswell, P. Genes regulating HLA class I antigen expression in T-B lymphoblast hybrids. Immunogenetics. 21 (3), 235-246 (1985).
  24. Snauwaert, S., et al. In vitro generation of mature, naive antigen-specific CD8(+) T cells with a single T-cell receptor by agonist selection. Leukemia. 28 (4), 830-841 (2014).
  25. Takahama, Y., Suzuki, H., Katz, K. S., Grusby, M. J., Singer, A. Positive selection of CD4+ T cells by TCR ligation without aggregation even in the absence of MHC. Nature. 371 (6492), 67-70 (1994).
  26. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  27. Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Current Protocols in Cell Biology. , (2007).
  28. Vizcardo, R., et al. Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System. Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).
  29. McNicol, A. M., et al. CD8alpha/alpha homodimers fail to function as co-receptor for a CD8-dependent TCR. European Journal of Immunology. 37 (6), 1634-1641 (2007).
  30. Themeli, M., Riviere, I., Sadelain, M. New cell sources for T cell engineering and adoptive immunotherapy. Cell Stem Cell. 16 (4), 357-366 (2015).
  31. Minagawa, A., et al. Enhancing T Cell Receptor Stability in Rejuvenated iPSC-Derived T Cells Improves Their Use in Cancer Immunotherapy. Cell Stem Cell. 23 (6), 850-858 (2018).
  32. Montel-Hagen, A., et al. Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 24 (3), 376-389 (2019).
  33. Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus. Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).
  34. Takada, K., et al. TCR affinity for thymoproteasome-dependent positively selecting peptides conditions antigen responsiveness in CD8(+) T cells. Nature Immunology. 16 (10), 1069-1076 (2015).
  35. Vizcardo, R., et al. A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants. JoVE. , e58672 (2019).

Tags

Human Induced Pluripotent Stem CellsTumor Antigen-specific T CellsOP9-Delta-1 Co-cultureT Cell GenerationRegenerative MedicineCell-based TherapyNK CellsCell DifferentiationCell PassagingMouse Embryonic FibroblastsOP9 Media

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Good, M. L., Vizcardo, R., Maeda, T., Tamaoki, N., Malekzadeh, P., Kawamoto, H., Restifo, N. P. Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells. J. Vis. Exp. (152), e59997, doi:10.3791/59997 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image