종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

1. 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF)에 인간 iPSCs (hiPSCs) 배양 참고: hiPSCs배양에 대한 대체 방법은 또한 사용될 수 있다: 젤라틴으로 미리 코팅된 6개의 웰 플레이트상에 시드, 젤라틴 단백질 혼합물, 재조합 라미닌 511, 또는 hiPSC 확장에 사용되는 임의의 다른 세포외 매트릭스, 및 인간 다능성 줄기 세포 배양을 위해 특별히 제조 된 정의 된 미디어를 사용하여 배양. MEF 배양 10 cm 세포 배양 페트리 접시를 0.1% 젤라틴 4 mL로 코팅하고 37°C에서 30분 동안 배양한다. 37°C MEF 매체의 10 mL로 4 x 106의 유리병을 빠르게 해동시주세요(DMEM + 10% FBS + 1x 페니실린-스트렙토마이신 + 1x L-글루타민 보충제). 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리기. 상월체를 흡인하고 MEF 매체의 9 mL에서 세포 펠릿을 재중단시켰다. 인큐베이터에서 젤라틴 코팅 접시를 제거합니다. 젤라틴을 흡인하고 MEF 미디어 7 mL을 추가합니다. MEF 서스펜션의 플레이트 3 mL (단계 1.1.2에서) 젤라틴 코팅 접시에. 접시를 좌우로, 앞뒤로 흔들어 서 MEF를 접시 위에 고르게 분배합니다. 8-36 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오. MEF에서 hiPSC 통과참고: 데이터는 앞서 설명한18에서와 같이 HLA-A*02:01의 맥락에서 MART-1 펩티드를 구체적으로 인식하는 장기 배양 흑색종 TIL에서 파생된 MART-1 iPSC를 사용하여 생성되었다. 콜로니가 직경이 0.8 – 1.2 mm 사이일 때 통로 hiPSCs. 통과하기 전에, 스테레오 현미경으로 hiPSC 콜로니를 확인하고 200 μL 팁의 플라스틱 가장자리를 사용하여 배양에서 분화의 모든 영역을 제거합니다. 흡기 는 10 mL hiPSC 배지 (인간 ES 배양 배지 [재료표]+ 10 ng/mL 인간 기본 섬유아세포 성장 인자 [hbFGF]]를 10 μM ROCK 억제물로 보충하였다. 한 손에 세포 배양 접시를 잡고 일회용 셀 패시징 도구를 한 방향으로 전체 접시에 걸쳐 굴려. 롤러 블레이드 전체가 배양 접시에 닿을 수 있도록 충분한 압력을 가하고 롤링 동작 중에 균일한 압력을 유지합니다. 배양 접시를 90° 회전시키고 1.2.3단계를 반복합니다. 현미경으로 판을 보고 선별된 것처럼 보이는 식민지의 적절한 절단을 시각적으로 확인합니다. 200 μL 파이펫을 사용하여 부드러운 기계적 플러싱으로 식민지를 분리합니다.참고: 기계적 홍조에 의한 절단 식민지의 분리는 3 분 후 절단 식민지가 접시에 다시 부착하기 시작하기 때문에, 롤러로 식민지를 절단 한 직후 수행해야하며, 플러싱에 의해 균일 한 크기의 식민지를 분리하기 가 어려워질 것입니다. 10 μM ROCK 억제제와 함께 10 mL의 신선한 hiPSC 매체로 350 – 600 덩어리의 절단 콜로니를 MEF의 새로운 10cm 접시 (hiPSC 패싱 전에 8 – 36 시간 도금)로 옮김. 37 °C에서 배양하십시오.참고: 600 개의 덩어리는 약 1.0 x 106 MART-1 iPSC를 나타내며 35 일째에는 0.5-1.0 x 106 DP 셀을 생성합니다. 그러나, 예상된 수치는 시작 세포주 및 배양 조건의 효능에 따라 달라질 것이다. 다음 날, 흡인은 미디어를 소비하고 신선한 hiPSC 미디어의 10 mL를 추가합니다. hiPSC 성장률에 따라 1-2일마다 hiPSC 미디어를 변경합니다. 2. HIPSCs와 공동 배양OP9/DLL1 셀 의 준비 OP9 배지에서 배양 OP9/DLL1 세포 [α-최소 필수 배지 (α-MEM) + 20% 태아 소 혈청 (FBS) + 1x 페니실린-스트렙토마이신] 37°C. OP9/DLL1 세포가 합의에 도달하면, 흡인제와 1x 마그네슘, 칼슘 및 페놀 무홍 인산염 완충식염수(PBS)의 5 mL로 한 번 세척합니다. PBS를 흡인하고 0.05 % 트립신 -EDTA의 2 mL을 추가합니다.  37 °C에서 5 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 OP9 매질 4 mL을 추가하고 피펫팅을 하여 세포 층을 기계적으로 해리시켜 단일 셀 현탁액을 만듭니다. 세포 뭉침을 피하기 위해 100 μm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 원추형 튜브로 세포 현탁액을 옮김을 전달합니다. 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리기. OP9 미디어의 12 mL에서 상급을 흡인하고 다시 일시 중단합니다. 6개의 새로운 10cm 세포 배양 페트리 접시각각에 8 mL의 OP9 배지를 추가합니다. 2.3 단계에서 OP9/DLL1 셀 현탁액의 플레이트 2 mL를 각 새로운 10cm 접시에. 접시를 좌우로 흔들고 앞뒤로 흔들어 접시에 OP9/DLL1을 균일하게 분배합니다. 37 °C에서 배양하십시오. 세포가 합류에 도달할 때 2 – 3 일마다 반복합니다.참고: OP9/DLL1 셀의 충분한 냉동 재고를 만들고 4-6 주마다 새로운 주식을 해동하는 것이 중요합니다. 3. 시험관 내 HIPSCs를 CD8αβ+ 단일 양성(SP) T 세포로 분화 hipsCs와 공동 배양하기 일주일 전에 젤라틴화된 OP9/DLL1 요리를 준비합니다. 0.1% 젤라틴 용액을 준비하려면 5 mL의 실온 (RT) 조직 등급 스톡 젤라틴 용액을 PBS 500 mL에 추가하십시오. 3개의 새로운 10cm 세포 배양 페트리 접시를 접시당 0.1% 젤라틴의 4 mL를 첨가하였다.  37 °C에서 30 분 배양. 젤라틴을 흡인하고 각 접시에 OP9 용지 8 mL을 추가합니다. OP9/DLL1(위의 섹션 2에서 와 같이)의 한 가지 동시 접시를 3개의 젤라틴 사전 코팅 접시로 통로로 처리합니다. 4일 후, 젤라틴에 OP9/DLL1의 각 10cm 접시에 OP9 용지 10 mL을 추가하여 접시당 총 20 mL의 미디어를 사용하십시오. 7-8일 후, OP9/DLL1 동시 접시(분화일 0)에서 hiPSC 공동 배양을 시작한다. 흡인은 MEF에 hipsCs의 confluent 10cm 접시에서 미디어를 보냈다. OP9 용지의 10mL를 추가합니다. 1.2.3 단계 및 1.2.4 단계에서 수행 된 일회용 셀 패싱 도구를 사용하여 hiPSC 콜로니를 잘라 내고 분리합니다. 200 μL 파이펫을 사용하여 10 mL의 신선한 OP9 용지와 함께 10cm 미리 젤라틴화 OP9 / DLL1 접시 (단계 3.1)에 절단 콜로니 의 350 – 600 덩어리를 전송합니다. 배양 접시를 좌우로 흔들고 앞뒤로 흔들어 식민지의 균일한 분포를 보장합니다.참고: 대안적으로, 미리 형성된 hiPSC 배아체(EBs) 또는 작은 덩어리 현탁액이 사용될 수 있다.  그러나, 일회용 셀 패싱 툴 또는 EB 형성 시스템의 사용은 균일한 크기의 hiPSC 덩어리를 생산하는 것이 바람직하다. 1일째, 흡인은 미디어를 소비하고 신선한 OP9 미디어 20 mL로 교체했습니다. 1일 동안 OP9/DLL1에 공동 배양된 hiPSC 덩어리는 작은 둥근 단층 콜로니로나타납니다(그림 1). 5일째에는 10mL의 소비 매체를 흡인하고 신선한 OP9 용지 10mL를 추가합니다. hiPSC 식민지는 다층 어두운 중심을 특징으로하는 원시 중미로 분화하기 시작합니다. 9일째에는 10mL의 소비 매체를 흡인하고 신선한 OP9 미디어를 10mL 추가합니다. 이 시점에서 다층 중심 구조는 돔 모양으로 진화하고 주변 네트워크와 같은 영역이 분명해지기 시작합니다. 13일째에 조혈 전구 세포(HPC)를 수확합니다(그림 1). 13일째에 hiPSC 유래 구조는 돔과 같은 영역의 네트워크로 둘러싸인 어두운 중앙 오르가노이드를 특징으로 하며, 이전에 인간 배아 줄기 세포 유래 조혈 전구체를 둘러싸고 있다고 보고된 조혈 영역(HZs)을 대표합니다. 21.참고: 돔형 구조물이 존재하면 어두운 중심이 없는 경우에도 성공적인 공정을 나타냅니다. CCC를 생산하는 무능력은 OP9/DLL1의 품질 저하, FBS 로트 품질, OP9/DLL1(350-600 덩어리)에 시드된 iPSC 덩어리의 합류, 및/또는 조혈 전구체를 생산하기 위한 iPSC 라인의 효능 의 변화로 인한 것일 수 있습니다. 흡인은 칼슘과 마그네슘(HBSS)으로 변형된 1x 페놀 무첨가 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 5 mL로 미디어를 소비하고 1x를 세척하였다. HBSS를 흡인하고 HBSS 10 mL에 5000 단위/mL 콜라게나아제 IV 250 μL을 추가합니다. 37°C에서 45분 동안 배양합니다. PBS를 흡인하고 0.25 % 트립신 -EDTA의 5 mL을 추가합니다. 37°C에서 20분 동안 배양합니다. 이어서, OP9 매질 4 mL을 첨가하고 단일 셀 현탁액을 만들기 위해 파이펫팅하여 세포 층을 해리한다. 100 μm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 원점 튜브로 세포 현탁액을 전송합니다.  4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리기. OP9 미디어의 10 mL에서 상급을 흡인하고 다시 일시 중단합니다. 새로운 젤라틴화된 10 cm 세포 배양 페트리 접시 상에 플레이트 세포 현탁액(단계 3.1.1 및 3.1.2 참조). 37°C에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 부드러운 파이펫팅으로 비 부착 세포를 수집합니다. 수집된 세포 현탁액을 100 μm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 원점 튜브로 이송한다.  4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리기. 분화 매체의 10 mL에서 상피 및 재중단 [OP9 5 ng/mL 인간 줄기 세포 인자 (hSCF), 5 ng/mL 인간 Flt3 리간드 (hFLT3L), 및 5 ng/mL 인간 인터류핀 7 (hIL-7)]. 셀 서스펜션을 새로운 10cm OP9/DLL1 동시 접시에 접시에 놓습니다. 16 일째에 세포를 통과시다. 100 μm 셀 스트레이너를 통해 부드러운 파이펫팅 및 필터에 의해 기계적으로 부착되지 않은 세포를 분리합니다. 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리기. 상월체를 흡인하고 10 mL 분화 매체에서 재중단한다. 셀 서스펜션을 새로운 10cm OP9/DLL1 동시 접시에 접시에 놓습니다. 그 후 5-7일마다 3.8단계를 반복하여 비부착 세포를 계속 통과시다. 35일째에,CD4+CD8+ 이중 양성(DP) 집단을 풍부하게 하고 CD8αβ+ SP T 세포를 생성하도록 자극한다(그림 2). 100 μm 세포 스트레이너를 통해 부드러운 파이펫팅및 필터에 의해 비부착 세포를 기계적으로 분리하여 세포 덩어리를 제거합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 CD4 자기 비드 절연에 의해 CD4+ 세포 집단을 풍부하게 합니다.참고: CD4 자기 비드를 사용하기 위한 근거는CD4-CD8-DN세포를 배양으로부터 제거하는 것이며, 이들은 자극 후 CD4+ CD8+ DP 세포의 직접적인 살해를 유발하는 것으로 입증되었다22. Neubauer 혈세포계 및 트리판 블루 염료를 사용하여 살아있는 CD4 농축 세포를 계산합니다.  총 농도 0.5 x 106 세포/mL에서 OP9 용지에 중단합니다. 세포 현탁액의 1 mL(0.5 x 106 세포)을 조직 배양 플랫 하부 24웰 플레이트의 각 웰 내로 결합OP9/DLL1의 웰 플레이트. 100 IU 인간 인터류키틴 2(hIL-2), 5 ng/mL hIL-7, 500 ng/mL 항인간 CD3 항체, 2 μg/mL 항인간 CD28 항체를 추가한 다음 37°C에서 배양합니다. 자극 후 4일째-7일째에, 분자 분석을 위한 세포를수집(도 3)또는 펩티드 펄스 항원 제시 세포(APC)와 공동 배양한다. 4. hiPSC 유래 CD8αβ+ SP T 세포의 항원 특이성 측정 참고: 이러한 엑세지먼트에 사용되는 APC의 유형은 hiPSC 유래 T 세포의 MHC 제한에 의존한다. 여기서, T2 세포주가 사용되며, 이는 T 및 B 림프구성 세포주의 하이브리드이다. T2 세포는 HLA-A*02:0123을발현하며, 이는 MART1-iPSC가18에서파생된 JKF6 세포에 의해 인식된다. 이 T2 세포주 RPMI 1640 + 20% FBS + 1x 페니실린-스트렙토마이신에서 확장될 수 있으며 세포가 5 x 105 세포/mL의 밀도에 도달할 때 통과됩니다. 살아있는 HLA-A*02:01+ T-B 하이브리드 림프구성 T2 세포는 Neubauer 혈세포계와 트리판 블루 염료를 사용한다. 37°C에서 2시간 동안 1 μg/mL MART-1 펩티드로 24개의 웰 조직 배양 플레이트에서 APC를 배양하였다.참고: 최적의 펩타이드 농도는 세포주 및 항원 특이성에 따라 가변적이다. APC를 수집하고 10 mL의 PBS로 2x를 세척하여 여분의 펩티드를 제거합니다. APC를 계산하고 OP9 미디어에서 100 IU IL-2 및 5 ng/mL IL-7로 2 – 5 x 105 셀/mL에서 중단합니다. Aliquot 100 μL의 셀 서스펜션(2-5 x 104 세포)을 각각의 웰 내로 초저 부착 U 하부 96 웰 플레이트 또는 미리 코팅된 ELISpot 플레이트내로 직접 넣는다. hiPSC 유래 CD8αβ+ SP T 세포(항인간 CD3/CD28 항체 자극 후 1주일)를 세포 선별기를 사용하여 100 IU IL-2 및 5 ng/mL IL-7로 OP9 매체에서 1 x 106 세포/mL에서 중단한다. Aliquot 100 μL의 세포 현탁액(1 x 105 세포)을 37°C에서 16-20시간 동안 각각의 AFC 및 배양물 내로 내보훈한다. 16-20시간 후, 제조사의 프로토콜에 따라 ELISpot 분석에 의한 사이토카인 분비 프로파일을 분석한다(도4).