使用声学纳米分配技术实现高通量DNA质粒多路复用和转染

这里介绍的方法详细介绍了如何在384孔板中使用声基液体纳米分配器在高通量的哺乳动物细胞中执行DNA质粒多路复用和转染,即使是对于该领域的非专家也是如此。最近公布的方法1允许在一个实验中执行多达384个独立的质粒DNA复用和转染条件,在不到1小时。转染细胞群中的共转染。此协议使转染更容易,因为大多数繁琐、耗时且容易出错的步骤现在都是软件驱动的(有关概述,请参阅图1)。已作出进一步努力,开发专用工具,以提高易用性,同时避免整个过程中的人为错误,并促进成功的转染,即使是外地的非专家。所述协议包括一个”用户友好”的宏电子表格,我们开发了该电子表格,以便管理 384 个独立的转染条件,每个孔中最多具有四个质粒的多路复用可能性。宏自动生成源板的模板,以从起始库存解决方案加载预期的 DNA 质粒体积,并在已输入的实验设计后启动纳米分配器软件所需的文件。由于在384孔源盘中手动分配DNA是繁琐且容易出错的,我们还开发了一个基于平板电脑的专用应用程序,在根据模板分配DNA溶液的同时指导用户。

图1:实验工作流。最佳自动化高通量反向转染协议(从实验设计到定制生物测定)的原理表示。手动步骤由手符号指示,每个步骤的大致时间写在红色框中。请点击此处查看此图的较大版本。

许多基于细胞的实验从质粒DNA转染开始,即使许多专用试剂已经和仍在开发中,以提高转染效率和/或简化程序,仍有许多工作要做2,3^,4.DNA质粒细胞转染涉及几个步骤,以达到高效率,如初始复杂接受,内皮逃逸,和细胞质传输到细胞核5,6。除了钙沉淀或物理技术,如电穿孔或显微注射使用专用装置7,现代化学方法已侧重于加强DNA细胞交付,同时降低细胞细胞毒性8, ⁹.使用脂质或阳离子聚合物形成脂质体状复合物,以及最近的非脂体聚合物化学系统使转染更容易和更有效^率10。尽管有这些发展,细胞转染仍然需要具体技能,以准确执行,因为大多数物理或化学转染协议要求科学家手动准备每个DNA转染反应条件,因此影响吞吐量。为了规避这个问题,利用化学转染试剂11、12、13开发了反向转染方案,使用户能够更快地测试或组合几个质粒。在这些协议中,在将细胞播种到复合物上之前,与转染试剂形成核酸复合物。然而,这些反向协议仍然受到DNA溶液的手动处理和每个独立条件的组合的限制。虽然以96孔板格式进行它们是可行的,但DNA的制备和分配将单调乏味,并且可能会有错误。当需要不同数量的DNA质粒并相互多路复用时,细胞转染就更难实现,而且更加耗时,人为错误也变得相当不可避免。尽管很少多路复用DNA转染条件,但以反向转染方法扩展到384孔板格式,由于以下原因,成为一个不可能的挑战。i) 要管理的DNA量、转染试剂或反应混合物体积低于每口井的1μL。ii) 384个独立条件下质粒的多用性变得极其复杂。384口井的输送也非常耗时,而且容易出错。事实上,在预期井中分配正确的解决方案是很难管理的,因为已经分配的低容量不允许在空井和已满井之间进行目视监控。v) 最后,由于执行必要点胶步骤所需的时间,在加入细胞之前,蒸发干燥混合物的风险很高。总之,建立高通量DNA质粒转染测定的限制因素似乎是检测的小型化,这意味着小批量多路复用和管理,不能再手动处理,但也很难在由传统的围静态液体处理机的可靠方式。

为了证明自动化(如测定和获得高通量)的难度,到目前为止,只发布了几次自动转染的尝试:使用商业液体处理装置和磷酸钙沉淀^的96 孔板格式最近,一个利波莱克斯试剂,和一个微流体芯片,使280个独立的转染15,但需要这方面的专业技能。另一种方法,去磷,允许液体悬浮,并导致流体操纵和混合,用于执行DNA转染在24至96孔板^格式16。虽然可行,但这种方法的通量极低,因为细胞与DNA转染混合物的混合需要在播种前每一点孵育60s。这意味着整个 96 孔板的持续时间至少为 96 分钟。此外,由于这项工作是使用目前市场上没有的内部设计和制造设备完成的,因此该协议还远远不能让广大生物学家的观众满意。相反,在过去几年中,纳米体积分配器设备出现了一种易于使用的基于软件的声学点胶技术。利用聚焦声能,这些器件允许严格控制小液体体积从2.5 nL到500 nL从源板喷射到^{目的地17。}这种技术称为声滴喷射 (ADE),具有许多优点:它是全自动的、非接触的、无提示的、准确、精确且高度可重复的,并且具有高通量¹⁸。首次致力于提供二甲基硫酸盐(DMSO)解决方案,设置已增强,以分配水缓冲^液19。因此,声学纳米分配器似乎适用于反向细胞转染协议,并可以规避上述大多数手动限制。由于以前没有使用该技术描述过质粒转染尝试,我们最近评估了基于声学的点胶系统是否适合执行反向细胞转染。

利用纳米分给器的吞吐量和易用性,我们优化了HeLa细胞的反向转染方案,通过交叉测试几个参数,这些参数可以影响384孔单板的DNA转染,即总DNA量和源DNA起始浓度、稀释体积、转染试剂和扩散细胞数量。开发的协议规避了上述细胞转染的手动限制,与其他自动转染尝试具有若干优点。首先,它被小型化,从而允许通过节省DNA质粒制剂和转染试剂实现具有成本效益的转染试剂。其次,它比手动协议(即使是初学者)具有更高的吞吐量和可重现性,因为整个 384 孔板的转染可在 1 小时内实现。最后,它是软件驱动的,允许控制分配的DNA数量和多个质粒的多路复用。事实上,多亏了纳米分配器软件(材料表),用户可以制定一个研究计划来控制从定义的源井板到目的地的孔板的分配量。

此处提出的协议主要面向那些能够使用纳米分配器并希望在高通量下设置转染实验的用户,但也适用于那些希望通过以下形式快速优化特定细胞类型的转染参数的人。将该协议应用于在高吞吐量下交叉测试多个参数。事实上,我们已经表明,通过这种纳米尺度协议识别的优化参数可以转用于更大规模和手动转染实验。最后,由于本协议中使用的转染试剂允许根据制造商进行DNA或siRNA转染,该协议也对那些旨在执行基因过度表达或敲除的阵列方法的人感兴趣。预填充DNA的目的地板可在转染检测使用前7天保存,而不会失去功效,这是此类应用下协议的另一个优点。