High-throughput DNA plasmide multiplexing en transfectie met behulp van akoestische nano doseertechnologie

De hier gepresenteerde methode beschrijft in detail hoe DNA-plasmide multiplexing en transfectie in zoogdiercellen bij hoge doorvoer te voeren met behulp van een akoestische vloeibare nano dispenser in een 384-well plaat, zelfs voor niet-specialisten in het veld. Deze onlangs gepubliceerde methode¹ maakt het uitvoeren van zoveel 384 onafhankelijke plasmide DNA multiplexing en transfectie voorwaarden in één experiment, in minder dan 1 h. enkelvoudige of cotransfectie experimenten waren succesvol en bereikten een nabije 100% cotransfectie binnen de populatie van de getransfunteerde cellen. Dit protocol maakt transfectie gemakkelijker omdat de meeste vervelende, tijdrovende en foutgevoelige stappen nu software-gedreven zijn (Zie afbeelding 1 voor een algemeen overzicht). Er zijn verdere inspanningen geleverd om speciale instrumenten te ontwikkelen om het gebruiksgemak te verbeteren en tegelijkertijd menselijke fouten tijdens het algehele proces te voorkomen en om succesvolle Transfectie te bevorderen, zelfs voor niet-specialisten in het veld. Het beschreven protocol bevat een “gebruiksvriendelijk” macro-spreadsheet dat we hebben ontwikkeld om 384 onafhankelijke transfectie condities te beheren met multiplexing mogelijkheden van maximaal vier plasmiden in elke put. De macro genereert automatisch sjablonen van de bron plaat (en) om het verwachte DNA-plasmide volume te laden bij het starten van voorraadoplossingen en de bestanden die nodig zijn om de nanodispenser software te best Epen op het experimentele ontwerp dat is ingevoerd. Omdat het handmatig doseren van DNA in een 384-bron plaat vervelend en foutgevoelig is, ontwikkelden we ook een speciale Tablet-gebaseerde applicatie om de gebruiker te begeleiden tijdens het doseren van de DNA-oplossing volgens de sjabloon.

Figuur 1: experimentele workflow. Schematische weergave van het optimale geautomatiseerde omgekeerde transfectie protocol met hoge doorvoer (van experimenteel ontwerp tot aangepaste biologische assay). Handmatige stappen worden aangegeven door het hand symbool en de geschatte tijd voor elke stap wordt in een rood vak geschreven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Veel op cellen gebaseerde experimenten beginnen met plasmide DNA-transfectie, en zelfs als veel speciale reagentia zijn en nog steeds worden ontwikkeld om de transfectie-efficiëntie te verbeteren en/of de procedure te verlichten, moet er nog veel worden gedaan^{2,3 , 4}. DNA plasmide celtransfectie omvat verschillende stappen om een hoog rendement te bereiken, zoals een initiële complexe opname, endosomale ontsnapping en cytoplasmisch transport naar de Nucleus^5,6. Naast calcium neerslag of fysische technieken zoals elektroporation of Microinjection met behulp van speciale apparaten⁷, moderne chemische methoden hebben gericht op het verbeteren van DNA-cel levering terwijl het verlagen van de cel cytoxiciteit^{8, 9}. Het gebruik van lipiden of kationische polymeren die liposomen-achtige complexen vormen en, meer recentelijk, nonliposomale polymere chemie systemen heeft transfectie gemakkelijker en efficiënter gemaakt¹⁰. Ondanks deze ontwikkelingen vereist celtransfectie nog steeds dat specifieke vaardigheden nauwkeurig worden uitgevoerd, omdat de meeste van deze fysische of chemische transfectie protocollen wetenschappers verplichten om handmatig elke DNA-transfectie reactie voorwaarde voor te bereiden, dus de doorvoer aantasten. Om dit probleem te omzeilen, zijn reverse transfectie-protocollen ontwikkeld met behulp van chemische transfectie reagentia^11,12,13, waardoor de gebruiker meerdere plasmiden op een snellere manier kon testen of combineren. In deze protocollen worden nucleïnezuur complexen met transfectie reagentia gevormd voordat de cellen op de complexen worden zaaien. Deze omgekeerde protocollen worden echter nog steeds beperkt door de manuele behandeling van DNA-oplossingen en door de combinatie van elk van de onafhankelijke voorwaarden. Hoewel het haalbaar is om ze uit te voeren in een 96-goed plaat formaat, zullen de DNA-voorbereiding en-bedeling vervelend zijn en zullen er waarschijnlijk fouten zijn. Wanneer verschillende hoeveelheden van verschillende DNA plasmiden nodig zijn en Multiplexed met elkaar, wordt celtransfectie nog moeilijker te bereiken en meer tijdrovende, en menselijke fouten worden heel onvermijdelijk. Opschalen naar de 384-well plate formaat in een omgekeerde transfectie aanpak, ondanks enkele Multiplexed DNA transfectie omstandigheden, wordt een onmogelijke uitdaging om de volgende redenen. i) de DNA-bedragen, het transfectiereagens of het reactiemengsel dat moet worden beheerd, zijn voor elke put lager dan 1 μL. II) de multiplexing van plasmiden voor 384 onafhankelijke omstandigheden wordt uiterst ingewikkeld. De levering in elk van de 384 Wells is ook III) zeer tijdrovend en IV) foutgevoelig. Inderdaad, het doseren van de juiste oplossing in de verwachte putten is moeilijk te beheren omdat de lage volumes die al zijn gedoseerd geen visuele controle tussen de lege en reeds gevulde putten toestaan. v) ten slotte is er een hoog risico op het drogen van het mengsel door verdamping voordat de cellen worden toegevoegd als gevolg van de tijd die nodig is om de nodige doseerstappen uit te voeren. Samengevat, de beperkende factor voor het instellen van een hoge doorvoer DNA plasmide transfectie-assays lijkt de miniaturisatie van de assay te zijn, wat een laag volume multiplexing en beheer inhoudt dat niet meer handmatig kan worden afgehandeld, maar ook nauwelijks haalbaar is in een betrouwbare manier door klassieke peristatische vloeistof behandellers.

Als een bewijs van moeilijkheden om dergelijke testen te automatiseren en hoge doorvoer te krijgen, zijn er tot nu toe slechts een paar pogingen om Transfectie te automatisering gepubliceerd: a 96-well plate Format met behulp van een commerciële vloeistof handling apparaat en calciumfosfaat neerslag¹⁴ en, meer recentelijk, een lipoplex-reagens en een microfluïdische chip die 280 onafhankelijke transfecties mogelijk maakt¹⁵ , maar die gespecialiseerde vaardigheden op dit gebied vereisen. Een andere methode, acoustophoresis, die vloeistof levitatie mogelijk maakt en leidt tot vloeiende manipulatie en menging, werd gebruikt om DNA-transfectie uit te voeren in 24-tot 96-well plate formaten¹⁶. Hoewel haalbaar, deze aanpak lijdt aan een extreem lage doorvoer als het mengen van cellen met DNA-transfectie mengsel vereist een 60 s incubatie voor elk afzonderlijk punt voor het zaaien. Dit impliceert een duur van minstens 96 min voor een complete 96-well plaat. Bovendien is dit protocol verre van vatbaar voor het publiek van de algemene biologen, omdat dit werk werd gedaan met een in-House ontworpen en gefabriceerd apparaat dat momenteel niet op de markt verkrijgbaar is. Integendeel, in de afgelopen jaren is een eenvoudig te gebruiken software-gestuurde, op akoestiek gebaseerde doseertechnologie ontstaan met nano volume dispenser apparaten. Met behulp van gerichte akoestische energie, kunnen deze apparaten de strak gecontroleerde ejectie van kleine vloeibare volumes van 2,5 nL naar 500 nL van een bron plaat naar een bestemming één¹⁷. Deze technologie, genaamd Acoustic druppel uitwerp (ADE), heeft tal van voordelen: het is volledig geautomatiseerd, contactloos, tipless, nauwkeurig, nauwkeurig en zeer reproduceerbaar, en heeft een hoge doorvoer¹⁸. Voor het eerst gewijd aan het leveren van Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) oplossingen, zijn de instellingen verbeterd om water buffers te doseren¹⁹. Akoestische nano dispensers lijken dan geschikt voor Reverse Cell transfectie protocols en kunnen de meeste van bovengenoemde handmatige beperkingen omzeilen. Omdat er voorheen geen plasmide transfectie pogingen werden beschreven met behulp van deze technologie, evalueerden we onlangs de geschiktheid van een akoestisch-gebaseerd doseersysteem om omgekeerde celtransfectie uit te voeren.

Door de doorvoer en het gebruiksgemak van de nano dispenser te benutten, hebben we een reverse transfectie-protocol voor HeLa-cellen geoptimaliseerd door verschillende parameters te cross-testen die de DNA-trans fectie op een 384-put, één plaat kunnen beïnvloeden, namelijk de totale DNA-hoeveelheid en Bron-DNA start concentratie, verdunnings vloeistofvolume, transfectie reagens, en aantal verspreidings cellen. Het ontwikkelde protocol omzeilt de hierboven beschreven handmatige beperkingen van celtransfectie en presenteert verschillende voordelen ten opzichte van andere geautomatiseerde transfectie pogingen. Ten eerste wordt het geminiaturiseerd, waardoor kostenbesparend transfectie-reagens kan worden bespaard door DNA-plasmide preparaten en transfectie-reagens op te slaan. Ten tweede, het is veel meer hoge doorvoer en reproduceerbare dan de handmatige Protocol (zelfs voor beginners), als transfectie van een hele 384-goed plaat kan worden bereikt in minder dan 1 h. Tot slot, het is software-gedreven, waardoor de controle van de gedoseerde DNA-hoeveelheid en de multiplexing van verschillende plasmiden. Inderdaad, dankzij de nano dispenser software (tabel van de materialen), kan de gebruiker een studie plan uitwerken om de volumes te controleren die van een gedefinieerde bron goed plaat naar een bestemming worden gedoseerd.

Het protocol dat hier wordt gepresenteerd, is vooral bedoeld voor diegenen die toegang hebben tot een nano dispenser en die transfectie experimenten willen opzetten met een hoge doorvoer, maar ook voor diegenen die hun transfectie parameters voor een bepaald celtype snel willen optimaliseren door Dit protocol toepassen om verschillende parameters bij hoge doorvoer te cross-testen. Inderdaad, we hebben aangetoond dat geoptimaliseerde parameters geïdentificeerd met dit nanoschaal protocol kunnen worden omgezet in grotere schaal en handmatige transfectie experimenten. Ten slotte, aangezien het in dit Protocol gebruikte transfectie reagens DNA of siRNA transfectie toestaat volgens de fabrikant, is het protocol ook van belang voor diegenen die zich richten op het uitvoeren van array benaderingen voor genoverexpressie of knockdown. De bestemmings platen die met DNA zijn gevuld, kunnen tot 7 dagen voor gebruik in een transfectie test worden bewaard zonder verlies van werkzaamheid, wat een ander voordeel is van het volgende protocol voor dit soort toepassingen.