音響ナノディスペンス技術を用いたハイスループットDNAプラスミド多重化とトランスフェクション

ここで提示される方法は、384ウェルプレート内の音響ベースの液体ナノディスペンサーを用いて、哺乳類細胞におけるDNAプラスミド多重化およびトランスフェクションを高スループットで行う方法を詳細に説明する。この最近公開された^方法1は、1回の実験で384個もの独立プラスミドDNA多重化およびトランスフェクション条件を行うことを可能にし、1時間未満で単一または共トランスフェクション実験に成功し、ほぼ100%に達するトランスフェクト細胞集団内のコトランスフェクション。このプロトコルは、退屈で時間がかかり、エラーが発生しやすい手順のほとんどがソフトウェア駆動型であるため、トランスフェクションを容易にします (概要については、図 1を参照)。さらに、全体的なプロセス中の人為的ミスを回避しつつ、使いやすさを高め、現場の非専門家にとってもトランスフェクションの成功を促進するための専用ツールの開発に取り組んでいます。記述されたプロトコルには、各ウェルに最大 4 つのプラスミドの可能性を多重化する可能性を持つ 384 の独立したトランスフェクション条件を管理するために開発した「ユーザーフレンドリーな」マクロ スプレッドシートが含まれています。マクロは、入力された実験設計時にナノディスペンサーソフトウェアを駆動するために必要なファイルと、開始ストックソリューションから予想されるDNAプラスミドボリュームをロードするために、ソースプレートのテンプレートを自動的に生成します。384ウェルのソースプレートにDNAを手動で塗布するのは退屈でエラーが起こりやすいため、テンプレートに従ってDNA溶液を分配しながらユーザーを導く専用のタブレットベースのアプリケーションも開発しました。

図 1: 実験的なワークフロー。最適な自動ハイスループット逆トランスフェクションプロトコルの概略表現(実験設計からカスタム生物学的アッセイまで)。手動ステップは手の記号で示され、各ステップのおおよその時間は赤いボックスに書き込まれます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

多くの細胞ベースの実験はプラスミドDNAトランスフェクションから始まり、トランスフェクション効率を高め、手順を容易にするために多くの専用試薬が開発されている場合でも、多くのことが行われるべきである2、3^,4.DNAプラスミド細胞トランスフェクションは、初期複合体取り込み、エンドソームエスケープ、および核^への細胞質輸送などの高効率に到達するためのいくつかのステップを伴う5、6。カルシウム沈殿や専用デバイス7を用いてのエレクトロポレーションやマイクロインジェクションなどの物理的な技術に加えて、現代の化学的方法は、細胞の毒性を低下させながらDNA細胞送達を高めることに焦点を当ててきた8、 ⁹.リポソーム様複合体を形成する脂質またはカチオン性ポリマーの使用により、より最近では、非リポソーム高分子化学系はトランスフェクションをより容易かつ効率的^に10にした。これらの開発にもかかわらず、細胞トランスフェクションは、これらの物理的または化学的トランスフェクションプロトコルのほとんどが、科学者が手動で各DNAトランスフェクション反応状態を準備する必要があるため、正確に実行する特定のスキルを必要とします。スループットを損なう。この問題を回避するために、逆トランスフェクションプロトコルは、化学トランスフェクション試薬11、12、13を使用して開発され、ユーザがより速い方法で複数のプラスミドをテストまたは組み合わせることを可能にする。これらのプロトコルでは、トランスフェクション試薬を用いた核酸複合体が、複合体上の細胞を播種する前に形成される。しかし、これらの逆プロトコルは、DNA溶液の手動処理と、独立した条件のそれぞれの組み合わせによって依然として制限されています。96ウェルプレート形式で行うことが可能ですが、DNAの調製と分配は退屈であり、間違いが起こる可能性があります。複数のDNAプラスミドの異なる量が必要とされ、互いに多重化されると、細胞トランスフェクションを達成するのがさらに難しくなり、時間がかかり、ヒューマンエラーは非常に避けられません。逆トランスフェクションアプローチで384ウェルプレートフォーマットにスケールアップすることは、多重化されたDNAトランスフェクション条件が少ないにもかかわらず、以下の理由により不可能な課題となります。i) 管理するDNA量、トランスフェクション試薬、または反応混合物量は、各ウェルに対して1μL未満である。ii) 384の独立した条件に対するプラスミドの多重化は極めて複雑になる。384ウェルの各々における送達もiii)非常に時間がかかり、iv)エラーが発生しやすい。確かに、期待される井戸に適切なソリューションを分配することは、既に分配されている少量は空の井戸と既に充填された井戸の間の視覚的な監視を許可しないため、管理が困難です。v)最後に、必要な分配工程を行うために必要な時間のために細胞が添加される前に蒸発によって混合物を乾燥させる危険性が高い。要約すると、ハイスループットのDNAプラスミドトランスフェクションアッセイを設定する制限要因は、アッセイの小型化であり、これは、もはや手動では処理できないが、また、ほとんど達成できないことを意味するアッセイの小型化である。古典的な前立腺液体ハンドラーによって信頼できる方法。

このようなアッセイを自動化し、高スループットを得ることが困難な証拠として、トランスフェクションを自動化する試みは、これまでに発表されているだけです:市販の液体処理装置とリン酸カルシウム沈^殿14を使用した96ウェルプレートフォーマットそして、より最近では、リポレックス試薬、および280の独立したトランスフェ^{クション15}を可能にするマイクロ流体チップが、この分野で専門的なスキルを必要とします。別の方法は、アコストフォレシス、液体浮上を可能にし、流体操作および混合につながる、24〜96ウェルプレート^{フォーマット16}でDNAトランスフェクションを行うために使用された。実現可能ですが、DNAトランスフェクション混合物と細胞を混合するには、播種前に1点ごとに60sのインキュベーションが必要とされるため、このアプローチは非常に低いスループットに苦しみます。これは、完全な96ウェルプレートの持続時間が少なくとも96分を意味します。さらに、このプロトコルは、現在市場で入手できない社内で設計され、製造されたデバイスで行われたため、生物学者全体の聴衆に対して受け入れられるものからは程遠い。それどころか、ここ数年、ソフトウェア駆動の音響ベースのディスペンス技術がナノボリュームディスペンサーデバイスで登場しました。集中した音響エネルギーを使用して、これらの装置は、ソースプレートから宛先1¹⁷への2.5 nLから500 nLまでの小さな液体容積の厳密に制御された排出を可能にします。音響液滴の排出(ADE)と呼ばれるこの技術は多数の利点を有する:それは十分に自動化され、非接触、先端無し、正確、精密、および非常に再生可能であり、高いスルー^プット18を有する。最初にジメチルスルホキシド(DMSO)ソリューションの提供に専念し、水性^{バッファー19}を分配するように設定が強化されました。音響ナノディスペンサーは、その後、逆細胞トランスフェクションプロトコルに適しているように見え、上記の手動制限のほとんどを回避することができます。この技術を用いてプラスミドトランスフェクションの試みはこれまで述べられていなかったので、我々は最近、逆細胞トランスフェクションを行う音響ベースの分配システムの適合性を評価した。

ナノディスペンサーのスループットと使いやすさを活かし、384ウェル、シングルプレート、すなわち総DNA量とDNAトランスフェクションに影響を与える可能性のあるいくつかのパラメータをクロステストすることにより、HeLa細胞の逆トランスフェクションプロトコルを最適化しました。ソースDNA開始濃度、希釈体積、トランスフェクション試薬、および広がり細胞数。開発されたプロトコルは、細胞トランスフェクションの上述の手動制限を回避し、他の自動トランスフェクションの試みに対していくつかの利点を提示します。第1に、小型化により、DNAプラスミド製剤およびトランスフェクション試薬を保存することにより、費用対効果の高いトランスフェクション試薬を可能にします。第二に、384ウェルプレート全体のトランスフェクションが1時間未満で達成することができるので、それは手動プロトコル(初心者のためにも)よりもはるかに高スループットと再現性があります。最後に、それはソフトウェア主導であり、分配されたDNA量およびいくつかのプラスミドの多重化の制御を可能にする。確かに、ナノディスペンサーソフトウェア(材料のテーブル)のおかげで、ユーザーは、定義されたソースウェルプレートから宛先の1に分配されるボリュームを制御するための研究計画を精緻化することができます。

ここで提示されるプロトコルは、主にナノディスペンサーにアクセスし、高スループットでトランスフェクション実験を設定したい人を対象としていますが、特定のセルタイプに対するトランスフェクションパラメータを迅速に最適化したい方も対象です。このプロトコルを適用して、高スループットでいくつかのパラメータをクロステストします。実際、このナノスケールプロトコルで同定された最適化されたパラメータは、大規模かつ手動のトランスフェクション実験に移すことができることを示しました。最後に、本プロトコルで使用されるトランスフェクション試薬は、製造元に応じてDNAまたはsiRNAトランスフェクションを可能にするように、プロトコルは、遺伝子過剰発現またはノックダウンのための配列アプローチを行うことを目指す人にも興味がある。DNAで埋め込んだ宛先プレートは、有効性を損なうことなくトランスフェクションアッセイで使用する7日前まで保存することができ、この種のアプリケーションに対する次のプロトコルのもう一つの利点である。