Summary

In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato

Published: September 20, 2019
doi:

Summary

Este protocolo descreve um conjunto de métodos para identificar a conectividade funcional específica do tipo de célula de entradas de longo alcance de regiões cerebrais distantes usando estimulações optogenéticas em fatias de cérebro ex vivo.

Abstract

O conhecimento da conectividade sináptica específica do tipo celular é um pré-requisito crucial para a compreensão de circuitos neuronais cerebrais. A investigação funcional de conexões de longo alcance requer gravações direcionadas de neurônios únicos combinados com a estimulação específica de entradas distantes identificadas. Isto é frequentemente difícil de conseguir com técnicas convencionais e elétricas da estimulação, porque os axônios das áreas ascendentes convergentes do cérebro podem misturar-se na região de alvo. A segmentação estereotaxica de uma região cerebral específica para a expressão mediada por vírus de canais iônicos sensíveis à luz permite a estimulação seletiva de axônios originários daquela região com luz. As injeções Stereotaxic intracerebral podem ser usadas em estruturas bem delimitadas, tais como os núcleos thalamic anteriores, além do que outras áreas subcortical ou corticais durante todo o cérebro.

Descrito aqui é um conjunto de técnicas para a injeção estereotaxica precisa de vetores virais expressando channelrhodopsina no cérebro do rato, seguido por fotoestimulação de terminais AXON na preparação fatia do cérebro. Esses protocolos são simples e amplamente aplicáveis. Em combinação com a gravação da braçadeira de remendo da todo-pilha de um Neuron pós-sinapticamente conectado, o photoestimulação dos axônios permite a deteção de conexões sináptica funcionais, de caracterização farmacológica, e de avaliação de sua força. Além, o enchimento do biocytin do neurônio gravado pode ser usado para a identificação morfológica post-hoc do neurônio pós-sináptica.

Introduction

A definição de conectividade entre regiões cerebrais é necessária para compreender os circuitos neurais. Os métodos anatômicos de traçado clássicos permitem estabelecer a conectividade inter-regional, e os estudos da lesão ajudam a compreender a organização hierárquica do fluxo de informação. Por exemplo, os circuitos cerebrais para a orientação espacial e a sinalização do sentido da cabeça envolvem o fluxo direcional da informação do tálamo ao presubiculum. Isto foi demonstrado por estudos de lesão de núcleos talâmicos Antero-dorsais (ADN) que degradam o sinal de direção da cabeça no presubiculum dorsal a jusante, bem como osinal de célulade grade hipocampal1,2.

A conectividade funcional entre as áreas cerebrais é mais difícil de estabelecer a nível celular e subcelular. No hipocampo, uma anatomia altamente organizada permite investigar conexões sinápticas via-específicas usando simulação elétrica na preparação da fatia. Eletrodos de estimulação colocados no radiatum de estrato de CA1 podem ser usados para estimular especificamente a entrada colateral de Schaffer de3a. Estimular eletrodos colocados em estrato lacunosum moleculare de CA1 ativará a entrada derivação caminho para CA14,5. A estimulação elétrica ativa a liberação do neurotransmissor dos terminais do AXON; no entanto, ele ativa os neurônios com SOMATA perto do local de estimulação, bem como axônios de passagem. É, portanto, de uso limitado para estudar aferentes de regiões cerebrais definidas quando fibras de diferentes regiões de origem se misturam na estrutura-alvo, como é tipicamente o caso no neocórtex.

Os neurônios também podem ser estimulados com a luz. Os métodos ópticos incluem a fotoativação do glutamato enjaulado, que pode ser combinada com a digitalização a laser de um ou dois fótons. Vários locais com espaçamento próximo podem ser estimulados sequencialmente, sem danos mecânicos ao tecido6. Isso foi usado com sucesso para mapear os receptores sinápticos, bem como ativar os neurônios individuais7. Quando o glutamato que uncaging puder ser usado para a análise de circuito local, não permite a ativação específica de entradas de longo alcance.

Um método de escolha para a investigação da conectividade de longo alcance em circuitos neuronais é o uso da expressão de channelrhodopsina mediada por vírus. Usando injeções estereotaxicas in vivo como descrito aqui, a expressão de canais iônicos leves pode ser direcionada e espacialmente restrita a uma região cerebral desejada. Desta forma, channelrhodopsins são eficazes para mapear a conectividade excitatória ou inibitório de uma região para o seu alvo. Os terminais dos axônios transfected podem ser estimulados com luz em uma preparação da fatia do cérebro, e as gravações da remendo-braçadeira como uma leitura-para fora permitem o exame das funções e dos pontos fortes de componentes específicos do circuito no cérebro8. A aproximação optogenética combinada com a injeção Stereotaxic de um vírus oferece a especificidade sem precedentes e o controle genético9. Estimular com luz Adicionalmente permite a precisão temporal e espacial elevada10,11.

O presrubiculum é uma estrutura cortical de seis camadas na transição do hipocampo e a formação para-hippocampal12,13. Recebe a entrada sináptica importante do ADN11 mas também de diversas outras regiões corticais e subcortical14. Assim, a estimulação seletiva de terminais thalamic dos axônios dentro de uma fatia presubicular não é possível com estimulação elétrica nem glutamato uncaging. Descritos neste protocolo são métodos para determinar a conectividade funcional entre as regiões cerebrais (ADN e presubiculum) usando injeções estereotaxicas precisas de vetores virais expressando canais de luz bloqueada. Também descrito é a fotoestimulação dos terminais de axônios de projetar neurônios em sua região-alvo, juntamente com gravações de patch-Clamp de células inteiras de neurônios pós-sinápticos na preparação da fatia cerebral.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a diretiva do Conselho da Comunidade Europeia (2010/63/UE) e aprovados pelo Comitê de ética da Universidade de Paris Descartes. O experimentador deve obter autorização para que o procedimento cumpra as regulamentações locais. 1. planejamento do experimento Defina a área do cérebro a ser alvejada. Determine as coordenadas estereotaxicas do local da injeção com a ajuda de um Atlas do cérebro do rato<sup class="xref"…

Representative Results

O procedimento aqui apresentado foi utilizado para expressar uma channelrhodopsina sensível à luz azul (Chronos) fundida ao GFP no núcleo Antero-dorsal do tálamo (ADN), por injeção estereotóica de vírus anterógrado adeno-associado. As coordenadas Stereotaxic foram determinadas de acordo com um Atlas do cérebro do rato e testadas injetando 200 nL do fluoro-rubi fluorescente do Tracer. O animal foi sacrificado 10 min após a injeção, e o cérebro foi extraído e fixado durante a noite. As seções do cérebro c…

Discussion

A injeção viral in vivo para expressar opsinas sensíveis à luz em uma área cerebral definida é um método de escolha para a análise optogenética da conectividade funcional de longo alcance10,11,17,18. As injeções Stereotaxic oferecem a possibilidade para alvejar precisamente uma área específica do cérebro. A coexpressão de um opsina com um repórter fluorescente permite convenient…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Bertrand Mathon, Mérie Nassar, li-Wen Huang, e Jean Simonnet por sua ajuda no desenvolvimento de versões anteriores do protocolo de injeção estereotótaxica e Marin Manuel e Patrice Jegouzo para obter ajuda técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério francês da educação e investigação (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.), e Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).

Materials

0.5 mm bur  Harvard Apparatus 724962
10 µL Hamilton syringe Hamilton 1701 RN – 7653-01
10X PBS solution Thermofisher Scientific AM9624  text
36% PFA Sigma-Aldrich F8775
470 nm LED  Cairn Research P1105/470/LED  DC/59022m use with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP 
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Penn Vector Core AV-5-PV3446 lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 
All chemicals Sigma
Bath temperature controler Luigs & Neumann SM7 Set at 34°C 
beveled metal needle Hamilton 7803-05 33 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissors Dahle Allround 50038
Biocytin Sigma B4261 final 1-3 mg/ml
Borosilicate Capillaries Havard Apparatus GC150-10 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode puller Sutter Instruments P-87
BupH Phosphate Buffered Saline pack Thermofisher Scientific 28372
butterfly needle for perfusion Braun  Venofix A 24G
CCD Camera Andor  DL-604M
Confocal Microscope Zeiss LSM710 20X
curved forceps FST  11011-17
CY5 configuration (confocal) Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 
CY5 configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPI Sigma D9542
DAPI configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440A Axon Instruments
Digital handheld optical meter ThorLabs PM100D Parametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein Flashlight Nightsea DFP-1 excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTA Sigma E4368 final 0,2 mM
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse TE-2000E 10 or 20X
Filter paper Whatman
Fluoro-Ruby 10% Millipore AG335 disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
Heatingplate Physitemp HP4M
Heparin choay 5000 U.I./ml Sanofi 5 ml vial
HEPES Sigma H3375 final 10 mM
High speed rotary micromotor kit Foredom K.1070 maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse Stimulator A-M Systems 2100
KCl Sigma P4504 final 1,2 mM
Ketamine 1000 Virbac
Ketofen 10% Merial 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine) MSD 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgery Photonic (via Phymep) 10044
LED Power Supply Cairn Research OptoLED Light Source
Manipulators Luigs & Neumann SM-7
Mg-ATP 2H20 Sigma A9187 final 4 mM
MgCl2 Sigma 63069 final 2 mM
Micro temperature controler Physitemp MTC-1
Milk powder Carnation
MultiClamp 700B Axon Instruments
Na Phosphocreatine Sigma P7936 final 10 mM
Na3-GTP 2H20 Sigma G9002 final 0.4 mM
needle holder/hemostat FST 13005-14
pClamp acquisition software Axon Instruments
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3 14-16 on the display for 2-3 ml/min 
Potassium gluconate (K-gluconate) Sigma G4500 Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting medium Thermofisher Scientific P36390
Rompun 2% (xylazine) Bayer
small scissors FST 14060-09
Sodium chloride 0.9%  Virbac dilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZT VWR 630-1584
Stereotaxic frame with digital display Kopf Model 940 Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugate Life technologies  434315
Streptavidin-Cy5 conjugate Thermofisher Scientific S32357
Superglue3 Loctite Dutscher 999227 1g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid Ethicon F3210
Syringe pump kdScientific Legato 130 – 788130 Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicer Leica VT1200S speed 0.07, amplitude 1.
tubing Gilson F117942, F117946 Yellow/Black, Purple/Black
upright microscope Olympus BX51W1
Versi-dry bench absorbant paper Nalgene

References

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Citer Cet Article
Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (151), e59534, doi:10.3791/59534 (2019).

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