Summary

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

Published: September 20, 2019
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Summary

이 프로토콜은 생체 뇌 슬라이스에서 광유전학 자극을 사용하여 먼 뇌 영역에서 장거리 입력의 세포 유형 특정 기능적 연결을 식별하는 일련의 방법을 설명합니다.

Abstract

세포 형 특정 시냅스 연결의 지식은 뇌 전체 신경 회로를 이해하기위한 중요한 전제 조건입니다. 장거리 연결의 기능적 조사는 확인된 먼 입력의 특정 자극과 결합된 단 하나 뉴런의 표적으로 한 기록을 요구합니다. 이것은 종종 기존의 전기 자극 기술로 달성하기 어렵다, 수렴 에서 축색은 상류 뇌 영역을 혼합 할 수 있기 때문에 대상 영역에서 혼합 할 수 있습니다. 빛에 민감한 이온 채널의 바이러스 매개 표현을 위한 특정 뇌 영역의 입체 적 표적화는 빛으로 그 지역에서 유래 된 축전의 선택적 자극을 허용합니다. Intracerebral 입체 전염 주사는 두뇌를 통하여 그밖 피질 또는 피질 지역 이외에 전방 thalamic 핵과 같은 잘 분리된 구조물에서 이용될 수 있습니다.

여기서 설명된 것은 마우스 뇌에서 채널로도셉신을 발현하는 바이러스 벡터의 정확한 입체주입을 위한 기술세트이며, 이어서 뇌 슬라이스 제제에서 축사 말단의 광자극이 뒤따른다. 이러한 프로토콜은 간단하고 광범위하게 적용 가능합니다. 세포 내 로 연결된 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록과 결합하여 축삭의 광자극은 기능적 시냅스 연결, 약리학적 특성 및 강도 평가를 감지 할 수 있습니다. 또한, 기록된 뉴런의 바이오시틴 충진은 후배 형성 형 뉴런의 형태학적 식별에 사용될 수 있다.

Introduction

신경 회로를 이해하려면 뇌 영역 간의 연결을 정의하는 것이 필요합니다. 고전적인 해부학 추적 방법을 사용하면 지역 간 연결을 확립할 수 있으며 병변 연구는 정보 흐름의 계층 적 구성을 이해하는 데 도움이됩니다. 예를 들어, 공간 방향 및 머리 방향 신호에 대한 뇌 회로는 시상에서 구체로의 정보의 방향 흐름을 포함합니다. 이는 하류 등쪽 전구체에서 머리 방향 신호를 저하시키는 전방 등쪽 thalamic 핵(ADN)의 병변 연구뿐만 아니라 해마 격자 세포 신호1,2에의해 입증되었다.

뇌 영역 간의 기능적 연결은 세포 및 세포 내 수준에서 설정하는 것이 더 어렵습니다. 해마에서, 고도로 조직된 해부학은 슬라이스 준비에 있는 전기 시뮬레이션을 사용하여 통로 특정 시냅스 연결을 조사할 수 있습니다. CA1의 지층 라디에이터움에 배치된 자극 전극은CA333로부터샤퍼 부수적 입력을 구체적으로 자극하는데 사용될 수 있다. CA1의 지층 lacunosum 분자에 배치 자극 전극은 CA14,5에대한 천공 경로 입력을 활성화합니다. 전기 자극은 축슨 터미널에서 신경 전달 물질 방출을 활성화; 그러나, 그것은 통로의 축색뿐만 아니라 자극 부위 근처 소마타와 뉴런을 활성화. 따라서 전형적으로 신피질의 경우와 같이, 기원의 다른 영역의 섬유가 표적 구조에서 혼합될 때 정의된 뇌 영역에서 구심질을 연구하기 위한 제한된 사용이다.

뉴런은 또한 빛으로 자극될 수 있습니다. 광학 적 방법은 하나 또는 두 광자 레이저 스캐닝과 결합 될 수있는 케이지 조미료의 광 활성화를 포함한다. 여러 밀접하게 이격된 부위는 조직에 기계적 손상 없이 순차적으로 자극될 수 있다6. 이것은 성공적으로 시 냅 스 수용 체를 매핑 뿐만 아니라 개별 뉴런을 활성화 하는 데 사용 되었습니다7. 글루타메이트 무식은 로컬 회로 해석에 사용될 수 있지만 장거리 입력의 특정 활성화는 허용되지 않습니다.

신경 회로에서 장거리 연결의 조사를 위한 선택의 방법은 바이러스 매개 채널로도프신 발현의 사용이다. 여기에 설명된 바와 같이 생체 내 입체 주사를 사용하여, 광 문이 닫힌 이온 채널의 발현은 원하는 뇌 영역으로 표적화되고 공간적으로 제한될 수 있다. 이러한 방식으로, 채널러도셉신은 한 영역에서 표적으로 흥분제 또는 억제 연결을 매핑하는 데 효과적이다. 형질감염된 축사 단자는 뇌 슬라이스 제제에서 빛으로 자극될 수 있고, 판독으로 패치 클램프 기록은 뇌의 특정 회로 성분의 기능 및 강점을 검사할 수 있다8. 바이러스의 입체 적 주입과 결합 된 광유전학적 접근법은 전례없는 특이성 및 유전 적 대조군9을제공합니다. 빛을 자극하면 시간적 및 공간 적정밀도가 10,11로높아집니다.

예비는 해마및 파라해마 형성의 전이에서 6층 피질 구조이다12,13. 그것은 ADN11에서 중요한 시냅스 입력을 수신하지만 또한 몇몇 다른 피질 및 피질 영역(14)에서. 따라서, 서브실 슬라이스 내의 탈라믹 축사 단자의 선택적 자극은 전기 자극이나 글루타메이트 무형화로는 불가능하다. 이 프로토콜에 설명된 방법은 빛 문이 닫힌 채널을 발현하는 바이러스 벡터의 정확한 입체 적 주사를 사용하여 뇌 영역 (ADN 및 presubiculum) 사이의 기능적 연결을 결정하는 방법입니다. 또한 설명된 것은 뇌 슬라이스 제제에서 시냅스 후 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록과 결합된 표적 영역에서 뉴런을 투사하는 축세포 말단의 광자극이다.

Protocol

모든 절차는 유럽 공동체 이사회 지침 (2010/63/ EU)에 따라 수행되었으며 파리 데카르트 대학의 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 실험자는 현지 규정을 준수하기 위한 절차에 대한 허가를 받아야 합니다. 1. 실험 계획 대상으로 지정할 뇌 영역을 정의합니다. 마우스 뇌아틀라스(15)의도움으로 주사 부위의 입체 좌표를 결정한다. 오른쪽 전방 등쪽 탈라?…

Representative Results

여기에 제시된 절차는 시상(ADN)의 전방 등쪽 핵에서 GFP에 융합된 청색 광민감 채널로도인 채널로도프신(Chronos)을 발현하기 위해 사용되었으며, 전방 아데노 관련 바이러스의 입체주사에 의해 사용되었다. 입체 좌표는 마우스 뇌 아틀라스에 따라 결정되었고 형광 추적자 플루오로 루비 200 nL를 주입하여 테스트했습니다. 동물은 주사 후 10 분 희생되었고, 뇌는 하룻밤 동안 추출되고 고정되었습니다…

Discussion

정의된 뇌 영역에서 빛에 민감한 옵신을 발현하는 생체내 바이러스 주사는 장거리 기능적 연결성10,11,17,18의광유전학적 분석을 위한 선택방법이다. 스테레오택시 주사는 정확하게 뇌의 특정 영역을 대상으로 할 수있는 가능성을 제공합니다. 형광 리포터와 함께 opsin의 공동 발현은 정확한 주사 부위?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 버트 랜드 마톤, 메리 나사르, 리 웬 황, 그리고 장 시몬넷은 기술적 인 도움을 위한 스테레오 탁시컬 주입 프로토콜과 마린 마누엘과 파트리스 제구조의 이전 버전의 개발에 도움을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 교육 및 연구 프랑스 교육부에 의해 지원되었다 (L. R., L. S.), 센터 국립 데 에뛰데스 공간 (M. B.), 및 기관 국립 드 라 레처 그랜트 ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).

Materials

0.5 mm bur  Harvard Apparatus 724962
10 µL Hamilton syringe Hamilton 1701 RN – 7653-01
10X PBS solution Thermofisher Scientific AM9624  text
36% PFA Sigma-Aldrich F8775
470 nm LED  Cairn Research P1105/470/LED  DC/59022m use with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP 
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Penn Vector Core AV-5-PV3446 lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 
All chemicals Sigma
Bath temperature controler Luigs & Neumann SM7 Set at 34°C 
beveled metal needle Hamilton 7803-05 33 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissors Dahle Allround 50038
Biocytin Sigma B4261 final 1-3 mg/ml
Borosilicate Capillaries Havard Apparatus GC150-10 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode puller Sutter Instruments P-87
BupH Phosphate Buffered Saline pack Thermofisher Scientific 28372
butterfly needle for perfusion Braun  Venofix A 24G
CCD Camera Andor  DL-604M
Confocal Microscope Zeiss LSM710 20X
curved forceps FST  11011-17
CY5 configuration (confocal) Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 
CY5 configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPI Sigma D9542
DAPI configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440A Axon Instruments
Digital handheld optical meter ThorLabs PM100D Parametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein Flashlight Nightsea DFP-1 excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTA Sigma E4368 final 0,2 mM
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse TE-2000E 10 or 20X
Filter paper Whatman
Fluoro-Ruby 10% Millipore AG335 disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
Heatingplate Physitemp HP4M
Heparin choay 5000 U.I./ml Sanofi 5 ml vial
HEPES Sigma H3375 final 10 mM
High speed rotary micromotor kit Foredom K.1070 maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse Stimulator A-M Systems 2100
KCl Sigma P4504 final 1,2 mM
Ketamine 1000 Virbac
Ketofen 10% Merial 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine) MSD 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgery Photonic (via Phymep) 10044
LED Power Supply Cairn Research OptoLED Light Source
Manipulators Luigs & Neumann SM-7
Mg-ATP 2H20 Sigma A9187 final 4 mM
MgCl2 Sigma 63069 final 2 mM
Micro temperature controler Physitemp MTC-1
Milk powder Carnation
MultiClamp 700B Axon Instruments
Na Phosphocreatine Sigma P7936 final 10 mM
Na3-GTP 2H20 Sigma G9002 final 0.4 mM
needle holder/hemostat FST 13005-14
pClamp acquisition software Axon Instruments
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3 14-16 on the display for 2-3 ml/min 
Potassium gluconate (K-gluconate) Sigma G4500 Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting medium Thermofisher Scientific P36390
Rompun 2% (xylazine) Bayer
small scissors FST 14060-09
Sodium chloride 0.9%  Virbac dilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZT VWR 630-1584
Stereotaxic frame with digital display Kopf Model 940 Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugate Life technologies  434315
Streptavidin-Cy5 conjugate Thermofisher Scientific S32357
Superglue3 Loctite Dutscher 999227 1g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid Ethicon F3210
Syringe pump kdScientific Legato 130 – 788130 Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicer Leica VT1200S speed 0.07, amplitude 1.
tubing Gilson F117942, F117946 Yellow/Black, Purple/Black
upright microscope Olympus BX51W1
Versi-dry bench absorbant paper Nalgene

References

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Citer Cet Article
Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (151), e59534, doi:10.3791/59534 (2019).

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