Summary

Identificação de receptores de Orexin e endocanabinoides em zebrafish adulto usando métodos de imunoperoxidase e imunofluorescência

Published: June 25, 2019
doi:

Summary

São apresentados aqui protocolos para caracterização imuno-histoquímica e localização de peptídeo de Hipocretina, receptores de Hipocretina e receptores endocanabinoides no intestino e cérebros de modelos adultos de zebrafish de obesidade normal e induzida por dieta (Dio) usando immunoperixidase e métodos dobro da imunofluorescência.

Abstract

Immunohistochemistry (IHC) é uma técnica altamente sensível e específica envolvida na deteção de antígenos do alvo em seções do tecido com anticorpos etiquetados. É um processo multistep no qual a otimização de cada etapa é crucial para obter o sinal específico ideal. Através do IHC, pode-se detectar a distribuição e a localização de biomarcadores específicos, revelando informações sobre a conservação evolutiva. Além disso, o IHC permite a compreensão das mudanças de expressão e distribuição de biomarcadores em condições patológicas, como a obesidade. IHC, principalmente a técnica da imunofluorescência, pode ser usado no zebrafish adulto para detectar a organização e a distribuição de moléculas filogeneticamente conservadas, mas um protocolo padrão de IHC não é estasblished. Orexin e endocanabinóide são dois sistemas altamente conservados envolvidos no controle da ingestão de alimentos e patologia da obesidade. São relatados aqui os protocolos usados para obter a informação sobre o peptide do Hipocretina (Oxa), o receptor do Hipocretina (Ox-2R), e a localização e a distribuição do receptor do canabinóides (CB1R) no intestino e no cérebro de modelos adultos obesos normais e dieta-induzidos do zebrafish (Dio). Também são descritos os métodos de imunoperoxidase e imunofluorescência dupla, bem como a preparação de reagentes, fixação, incorporação de parafina, e crio-proteção do tecido zebrafish e preparação para um passo de bloqueio de atividade endógena e fundo contracoloração. O conjunto completo de parâmetros é obtido a partir de experimentos prévios de IHC, através dos quais mostramos como a imunofluorescência pode ajudar na compreensão de OXs, OX-2R e distribuição CB1R, localização e conservação da expressão em zebrafish adulto Tecidos. As imagens resultantes com intensidade de sinal altamente específica levaram à confirmação de que os zebrafish são modelos animais adequados para estudos imuno-histoquímicos de distribuição, localização e conservação evolutiva de biomarcadores específicos em condições fisiológicas e patológicas. Os protocolos aqui apresentados são recomendados para experimentos de IHC em zebrafish adulto.

Introduction

Immunohistochemistry (IHC) é uma técnica clássica bem estabelecida usada para identificar componentes celulares ou do tecido (antígenos) pela interação do antígeno-anticorpo1,2. Ele pode ser usado para identificar a localização e distribuição de biomoléculas alvo dentro de um tecido. O IHC utiliza reações imunológicas e químicas para detectar antígenos em secções teciduais3. Os principais marcadores utilizados para a visualização de interações antígeno-anticorpo incluem corantes fluorescentes (imunofluorescência) e reações de cor de substrato enzimático (imunoperoxidase), ambos conjugados a anticorpos4. Usar a observação microscópica é possível determinar a localização do tecido etiquetado, que corresponde aproximadamente à localização do antígeno do alvo no tecido.

Existem dois métodos para reações fluorescentes ou cromogênicas para detectar proteínas: o método de detecção direta, no qual o anticorpo primário específico é rotulado diretamente; e o método de detecção indireta, no qual o anticorpo primário é não conjugada enquanto o anticorpo secundário carrega o rótulo5,6,7. O método indireto tem algumas vantagens, que é principalmente a sua amplificação de sinal. Além disso, diferentemente de outras técnicas moleculares e celulares, com imunofluorescência, é possível visualizar a distribuição, localização e coexpressão de duas ou mais proteínas diferencialmente expressas dentro de células e tecidos7. A escolha do método de detecção utilizado depende dos detalhes experimentais.

Até o momento, o IHC é amplamente utilizado na pesquisa básica como uma ferramenta poderosa e essencial para a compreensão da distribuição e localização de biomarcadores e o perfilamento geral de diferentes proteínas no tecido biológico de humanos a invertebrados8, 9 anos de , 10 de , a técnica 11. The ajuda a indicar um mapa da expressão da proteína em um grande número de órgãos animais normais e alterados e de tipos diferentes do tecido, mostrando possível para baixo ou acima-regulação da expressão induzida por mudanças fisiológicas e patológicas. A IHC é uma técnica altamente sensível que requer precisão e a escolha correta dos métodos para obter os melhores resultados12. Em primeiro lugar, muitos fatores diferentes, como fixação, reatividade cruzada, recuperação de antígenos e sensibilidade de anticorpos, podem levar a sinais falsos positivos e falsos negativos13. A seleção dos anticorpos é uma das etapas mais importantes do IHC e depende da especificidade do antígeno e sua afinidade com a proteína e as espécies investigação7.

Recentemente, nós otimizamos a técnica de IHC para detectar membros de sistemas do hipocretin e do endocanabinóide do orexin/no tecido adulto do zebrafish. Temos focado principalmente na fixação, incorporação de tecidos usando duas abordagens diferentes, corte e montagem (o que pode afetar a resolução e detalhes durante a análise microscópica), e bloqueio (para evitar falsos positivos e reduzir o fundo)14. Outras características importantes são a especificidade do anticorpo e a seletividade e reprodutibilidade de protocolos individuais de IHC. A chave para fornecer a especificidade do anticorpo é o uso de controles negativos (incluindo sem anticorpos primários ou tecido que é conhecido por não expressar as proteínas-alvo), bem como controles positivos (incluindo o tecido que é conhecido por expressar as proteínas-alvo)15 . A seleção de anticorpos para IHC é feita com base em sua espécie-especificidade (a probabilidade com que reagem com o antígeno de interesse) e os sistemas de detecção de ligação antígeno-anticorpo que é usado4,5,6 ,7. No caso da imunoperoxidase, a cor da reação é determinada pela seleção do cromogénio precipitante, geralmente diaminobenzidina (marrom)16. Por outro lado, immunofluorescência utiliza anticorpos conjugados com um fluorophor para visualizar a expressão protéica em secções de tecido congelado e permite uma análise fácil de múltiplas proteínas em relação ao sistema de detecção cromogênica 5. º , o 7.

Na técnica da imunoperoxidase, o anticorpo secundário é conjugado à biotina, uma molécula de vinculador capaz de recrutar uma molécula de repórter cromogênica [complexo avidina-biotina (ABC)], levando à amplificação do sinal de coloração. Com o método do repórter do ABC, a enzima peroxidase reage com 3, 3 ‘-Diaminobenzidine (DAB), produzindo uma mancha intensamente marrom-colorida onde a enzima se liga ao anticorpo secundário, que pode então ser analisado com um microscópio claro ordinário. A coloração do ABC, devido à alta afinidade da avidina para a biotina, produz uma reação rápida e ótima, com poucos anticorpos secundários anexados ao local da reatividade do anticorpo primário. Este método de detecção cromogênica permite a análise densitométrica do sinal, fornecendo dados semiquantitativos baseados na correlação de níveis de sinal marrom com níveis de expressão protéica18.

Com técnicas da imunofluorescência, a deteção simultânea de proteínas múltiplas é possível devido à habilidade de fluorochromes diferentes emitir a luz em comprimentos de onda originais, mas é importante escolher fluorochromes com cuidado para minimizar a sobreposição espectral 5. Além disso, a utilização de anticorpos primários em diferentes espécies hospedeiras minimiza as dificuldades em relação à reatividade cruzada. Neste caso, cada anticorpo secundário espécie-específico reconhece somente um tipo de anticorpo preliminar. Os repórteres fluorescentes são moléculas orgânicas pequenas, incluindo derivados comerciais, tais como tinturas de Alexa fluor.

Muitos modelos animais são usados para compreender circunstâncias fisiológicas e patológicas particulares. Até o momento, estabelece-se que muitas vias metabólicas são conservadas ao longo da evolução. Conseqüentemente, os estudos de IHC em organismos modelo tais como o zebrafish podem fornecer a introspecção na génese e na manutenção de circunstâncias patológicas e não-patológicas17. É um objetivo deste relatório ilustrar protocolos de IHC que podem ser executados no tecido adulto do zebrafish e ser usados para obter imagens detalhadas da distribuição e da localização de OXA, de OX-2R, e de CB1R em níveis periféricos e centrais. Também são relatados protocolos para a aplicação de dois principais métodos indiretos de IHC em tecidos periféricos e centrais de zebrafish adulto. Descrito é o método indireto, que permite a amplificação do sinal nos casos onde um anticorpo secundário é conjugado a um corante fluorescente (método da imunofluorescência) ou ao repórter da enzima (método do immunoperoxidase). Os métodos de detecção cromogênico e fluorescente possuem vantagens e desvantagens. Relatado neste protocolo é o uso de IHC, principalmente a imunofluorescência, em zebrafish adulto, um modelo animal amplamente utilizado para estudar sistemas que são evolutivos conservadas em diferentes condições fisiológicas e patológicas.

Protocol

1. protocolo de imunoperoxidase Nota: o zebrafish foi obtido pelo Prof. Omid Safari (departamento de pescas, faculdade de recursos naturais e meio ambiente, Universidade Ferdowsi de Mashhad, Mashhad, Irã)10. Dissecção tecidual Sacrifique o zebrafish por submersão em água gelada (5 partes de gelo/1 parte de água, 4 ° c); deixá-los até a cessação de todo o movimento para garantir a morte por hipóxia. Remova rapid…

Representative Results

Os dados representativos para a coloração da imunoperoxidase são mostrados na Figura 1 e na Figura 2. A análise de immunohistochemical da distribuição de OX-A e de OX-2R no intestino do zebrafish adulto mostrou locais diferentes da localização de OX-A e de OX-2R e seus aumentos na expressão nas pilhas intestinais do zebrafish do DIO. Observou-se coloração marrom intensa para OX-a nas células do intestino medial e anterior (Figura…

Discussion

Preparação da amostra

A preparação da amostra é o primeiro passo crítico no IHC. Um protocolo confiável permite A manutenção da morfologia celular, da arquitetura tecidual e da antigenicidade. Esta etapa exige a coleção, a fixação, e o seccionamento corretos do tecido22,23. A finalidade da fixação é preservar o tecido e reduzir a ação de enzimas ou de micro-organismos do tecido. Em particular, …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado por Fondi ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, Universidade de Sannio.

Materials

Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

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Citer Cet Article
Imperatore, R., D’Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).

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