免疫ペルオキシダーゼおよび免疫蛍光法を用いて成体ゼブラフィッシュにおけるオレキシンおよびエンドカンナビノイド受容体の同定

免疫組織化学(IHC)は、抗原抗体相互作用1、2によって細胞または組織成分(抗原)を同定するために使用される確立された古典的な技術である。組織内の標的生体分子の局在化および分布を同定するために使用することができる。IHCは、組織セクション3の抗原を検出するために免疫学的および化学的反応を使用しています。抗原抗体相互作用の可視化に使用される主なマーカーには、蛍光色素(免疫蛍光)および酵素基質色反応(免疫ペルオキシダーゼ)が含まれ、いずれも^抗体4に共役する。顕微鏡観察を用いて、組織内の標的抗原の局在化にほぼ対応する標識組織の局在を決定することができる。

タンパク質を検出するための蛍光または発色反応には、特定の一次抗体が直接標識される直接検出方法の2つの方法があります。二次抗体が標識5、6、7を運ぶ間、一次抗体が結合されない間接検出方法。間接法には、主に信号増幅であるいくつかの利点があります。また、他の分子および細胞技術とは異なり、免疫蛍光を伴い、細胞および組織7内で分化して発現する2つ以上のタンパク質の分布、局在、および共発現を可視化することができる。使用される検出方法の選択は、実験の詳細に依存します。

現在までに、IHCは、バイオマーカーの分布と局在化を理解し、ヒトから無脊椎動物への生体組織における異なるタンパク質の一般的なプロファイリングを理解するための強力かつ不可欠なツールとして、基礎研究に広く使用されています8、^9,10歳,11.この技術は、多数の正常および変化した動物器官および異なる組織型におけるタンパク質発現の地図を表示するのに役立ち、生理学的および病理学的変化によって誘発される発現のダウンまたはアップレギュレーションの可能性を示す。IHCは、最適な結果を得るために正確さと方法の正しい選択を必要とする高感度技術^{です 12}.まず第一に、固定、交差反応性、抗原検索、および抗体の感受性などの多くの異なる因子は、偽陽性および偽陰性^{シグナル13}を引き起こす可能性がある。抗体の選択は、IHCにおける最も重要なステップの1つであり、抗原特異性および調査中のタンパク質および種との親和性^に依存する7.

最近では、成体ゼブラフィッシュ組織のオレキシン/ヒポクレチンおよびエンドカンナビノイド系のメンバーを検出するためにIHC技術を最適化しました。我々は主に固定、2つの異なるアプローチを使用して組織埋め込み、断面および取り付け(顕微鏡分析中の解像度および詳細に影響を与える可能性がある)、およびブロッキング(偽陽性を防止し、背景を減らすために)14に焦点を当てている。他の重要な特徴は、個々のIHCプロトコルの抗体特異性および選択性および再現性である。抗体特異性を提供する鍵は、負のコントロール(標的タンパク質を発現しないことが知られている一次抗体または組織を含まない)と陽性コントロール(標的タンパク質を発現することが知られている組織を含む)^{の使用である15}.IHCのための抗体の選択は、その種特異性(それらが目的の抗原と反応する可能性)および4、5、6を使用される抗原抗体結合検出システムに基づいて行われる。 ^、7.免疫ペルオキシダーゼの場合、反応の色は沈殿染色体の選択によって決定され、通常ジアミノベンジジン(褐色)16。一方、i mmuno蛍光は、蛍光結合抗体を利用して凍結組織切片におけるタンパク質発現を可視化し、発色検出システムに関して複数のタンパク質を容易に解析することができます。^5,7.

免疫ペルオキシダーゼ技術では、二次抗体をビオチンに結合させ、発色レポーター分子[アビジンビオチン複合体(ABC)]をリクルートすることができるリンカー分子であり、染色シグナルの増幅につながる。ABCレポーター法では、酵素ペルオキシダーゼが3,3′-ジアミノベンジジン(DAB)と反応し、酵素が二次抗体に結合する強烈な茶色の染色を生み出し、通常の光顕微鏡で分析することができます。ABC染色は、ビオチンに対するアビジンの親和性が高いため、一次抗体反応性の部位に付着した二次抗体がほとんどなく、迅速かつ最適な反応を生み出す。この発色検出方法は、シグナルの密度分析を可能にし、タンパク質発現^レベル18との褐色シグナルレベルの相関に基づく半定量的データを提供する。

免疫蛍光技術では、異なるフルオロクロムが独特の波長で発光する能力により、複数のタンパク質の同時検出が可能ですが、スペクトルの重複^{を最小限に抑えるために、蛍光色素を慎重に選択することが重要です。5.}さらに、異なる宿主種における一次抗体の使用は、交差反応性に関する困難を最小限に抑える。この場合、種特異的二次抗体は1種類の一次抗体のみを認識する。蛍光レポーターは、Alexa Fluor染料などの市販の誘導体を含む小さな有機分子です。

多くの動物モデルは、特定の生理学的および病理学的状態を理解するために使用される。今日まで、多くの代謝経路が進化の過程で保存されていることが確立されています。したがって、ゼブラフィッシュなどのモデル生物におけるIHC研究は、病理学的および非病理学的状態の起源および維持に関する洞察を提供^{することができる17.}この報告書は、成虫ゼブラフィッシュ組織に対して行うことができ、周辺および中央レベルでのOXA、OX-2R、およびCB1Rの分布および局在化の詳細な画像を得るために使用されるIHCプロトコルを示すことを目的とする。また、成ゼブラフィッシュの末梢および中央組織における2つの主要なIHC間接法の適用のためのプロトコルも報告されている。記載されている間接法は、二次抗体が蛍光色素(免疫蛍光法)または酵素レポーター(免疫ペルオキシダーゼ法)に結合した場合のシグナル増幅を可能にする。発色性および蛍光検出方法の両方に長所と短所があります。このプロトコルで報告されているのは、IHCの使用、主に免疫蛍光、成体ゼブラフィッシュにおいて、異なる生理学的および病理学的条件にわたって進化的に保存されるシステムを研究するために広く使用される動物モデルである。