Identificazione dei recettori Orexin ed Endocannabinoidi nei pesci zebra per adulti utilizzando i metodi di immunoperossiasi e immunofluorescenza

L’immunohistochimica (IHC) è una tecnica classica ben consolidata utilizzata per identificare i componenti cellulari o tissutali (antigeni) dall’interazione antigene-anticorpo^1,2. Può essere utilizzato per identificare la localizzazione e la distribuzione di biomolecole bersaglio all’interno di un tessuto. L’IHC utilizza reazioni immunologiche e chimiche per rilevare gli antigeni nelle sezioni tissutali³. I principali marcatori utilizzati per la visualizzazione delle interazioni antigene-anticorpo includono coloranti fluorescenti (immunofluorescenza) e reazioni di colore enzimatico-substrato (immunoperossiasi), entrambe coniugate agli anticorpi⁴. Utilizzando l’osservazione microscopica è possibile determinare la localizzazione del tessuto etichettato, che corrisponde approssimativamente alla localizzazione dell’antigene bersaglio nel tessuto.

Esistono due metodi per le reazioni fluorescenti o cromogeniche per rilevare le proteine: il metodo di rilevamento diretto, in cui l’anticorpo primario specifico è etichettato direttamente; e il metodo di rilevamento indiretto, in cui l’anticorpo primario è non coniugato mentre l’anticorpo secondario porta l’etichetta^5,6,7. Il metodo indiretto ha alcuni vantaggi, che è principalmente la sua amplificazione del segnale. Inoltre, a differenza di altre tecniche molecolari e cellulari, con l’immunofluorescenza, è possibile visualizzare la distribuzione, la localizzazione e la coespressione di due o più proteine espresse in modo differenziale all’interno di cellule e tessuti⁷. La scelta del metodo di rilevamento utilizzato dipende dai dettagli sperimentali.

Ad oggi, IHC è ampiamente utilizzato nella ricerca di base come uno strumento potente ed essenziale per comprendere la distribuzione e la localizzazione dei biomarcatori e la profilazione generale di diverse proteine nel tessuto biologico dall’uomo agli invertebrati^{8, 9} (in vie ^{, 10} del sistema ^{, 11}. La tecnica aiuta a visualizzare una mappa dell’espressione proteica in un gran numero di organi animali normali e alterati e diversi tipi di tessuto, mostrando possibili down o up-regolazione dell’espressione indotta da cambiamenti fisiologici e patologici. IHC è una tecnica altamente sensibile che richiede precisione e la corretta scelta dei metodi per ottenere risultati ottimali¹². Prima di tutto, molti fattori diversi come la fissazione, la reattività incrociata, il recupero dell’antigene e la sensibilità degli anticorpi possono portare a falsi segnali positivi e falsi negativi¹³. La selezione degli anticorpi è uno dei passi più importanti in IHC e dipende dalla specificità dell’antigene e dalla sua affinità con le proteine e le specie in esame⁷.

Recentemente, abbiamo ottimizzato la tecnica IHC per rilevare i membri dei sistemi orexin/ipocretin e endocannabinoidi nel tessuto ringiovanito del pesce zebra. Ci siamo concentrati principalmente sulla fissazione, l’incorporamento dei tessuti utilizzando due approcci diversi, il sezionamento e il montaggio (che possono influenzare la risoluzione e il dettaglio durante l’analisi microscopica) e il blocco (per prevenire falsi positivi e ridurre lo sfondo)¹⁴. Altre caratteristiche importanti sono la specificità dell’anticorpo e la selettività e riproducibilità dei singoli protocolli IHC. La chiave per fornire la specificità degli anticorpi è l’uso di controlli negativi (compresi gli anticorpi primari o i tessuti che è noto per non esprimere le proteine bersaglio) e controlli positivi (compresi i tessuti che è noto per esprimere le proteine bersaglio)¹⁵ . La selezione degli anticorpi per l’IHC viene effettuata in base alla loro specificità delle specie (la probabilità con cui reagiscono con l’antigene di interesse) e ai sistemi di rilevazione antigene-anticorpo utilizzati^{4,5,6 ,7}. Nel caso dell’immunoperossia, il colore della reazione è determinato dalla selezione del cromogeno precipitante, di solito diaminobenzidina (marrone)¹⁶. D’altra parte, immunofluorescencence utilizza anticorpi coniugati con un fluorophor per visualizzare l’espressione delle proteine in sezioni di tessuto congelato e consente una facile analisi di più proteine rispetto al sistema di rilevamento cromogenico ⁵ Del numero 3( ^{, 7}.

Nella tecnica dell’immunoperossiasi, l’anticorpo secondario viene coniugato alla biotina, una molecola del linker in grado di reclutare una molecola di reporter cromatogeno [complesso avidino-biotina (ABC)], che porta all’amplificazione del segnale di colorazione. Con il metodo reporter ABC, l’enzima perossidasi reagisce con 3,3′-diaminobenzidina (DAB), producendo una colorazione intensamente marrone dove l’enzima si lega all’anticorpo secondario, che può quindi essere analizzato con un microscopio luminoso ordinario. La colorazione ABC, a causa dell’alta affinità dell’avidina per la biotina, produce una reazione rapida e ottimale, con pochi anticorpi secondari attaccati al sito della reattività primaria dell’anticorpo. Questo metodo di rilevamento cromogenico consente l’analisi densitometrica del segnale, fornendo dati semiquantitativi basati sulla correlazione dei livelli di segnale marrone con i livelli di espressione delle proteine¹⁸.

Con le tecniche di immunofluorescenza, il rilevamento simultaneo di più proteine è possibile grazie alla capacità di fluorocromi diversi di emettere luce a lunghezze d’onda uniche, ma è importante scegliere con attenzione i fluorocromi per ridurre al minimo la sovrapposizione ^{spettrale 5}. Inoltre, l’uso di anticorpi primari in diverse specie ospiti riduce al minimo le difficoltà relative alla reattività incrociata. In questo caso, ogni anticorpo secondario specifico della specie riconosce solo un tipo di anticorpo primario. I reporter fluorescenti sono piccole molecole organiche, compresi i derivati commerciali, come i coloranti Alexa Fluor.

Molti modelli animali sono utilizzati per comprendere particolari condizioni fisiologiche e patologiche. Ad oggi, è stabilito che molte vie metaboliche sono conservate nel corso dell’evoluzione. Pertanto, gli studi IHC in organismi modello come il pesce zebra possono fornire informazioni sulla genesi e il mantenimento delle condizioni patologiche e non patologiche¹⁷. L’obiettivo di questa relazione è illustrare i protocolli IHC che possono essere eseguiti sul tessuto del pesce zebra adulto e utilizzati per ottenere immagini dettagliate della distribuzione e localizzazione di OXA, OX-2R e CB1R a livello periferico e centrale. Sono riportati anche protocolli per l’applicazione di due principali metodi indiretti IHC nei tessuti periferici e centrali del pesce zebra adulto. Descritto è il metodo indiretto, che consente l’amplificazione del segnale nei casi in cui un anticorpo secondario viene coniugato a un tintura fluorescente (metodo di immunofluorescenza) o reporter enzimatico (metodo immunoperossidasi). Entrambi i metodi cromogenici e fluorescenti di rilevamento possiedono vantaggi e svantaggi. Riportato in questo protocollo è l’uso di IHC, principalmente immunofluorescenza, nel pesce zebra adulto, un modello animale ampiamente utilizzato per studiare i sistemi che sono evolutivi conservati in diverse condizioni fisiologiche e patologiche.