Het succes van een time-resolved seriële femtoseconde kristallografie experiment is afhankelijk van efficiënte monster levering. We beschrijven hier protocollen voor het optimaliseren van de extrusie van de bacteriorhodopsin microcrystals van een hoge viscositeit micro-extrusie injector. De methodologie steunt op monster homogenisering met een roman drieweg koppelstuk en visualisatie met een high-speed camera.
Dikvloeibaar micro-extrusie injectoren gedaald dramatisch monster consumptie in seriële femtoseconde kristallografische experimenten (SFX) op X-ray vrije elektron lasers (XFELs). Een reeks van experimenten met behulp van de licht-gedreven proton pomp bacteriorhodopsin hebben verder deze injectoren opgericht als een voorkeursoptie te leveren crystals voor seriële femtoseconde time-resolved kristallografie (TR-SFX) voor het oplossen van de structurele veranderingen van eiwitten na photoactivation. Voor het verkrijgen van meerdere structurele momentopnamen van hoge kwaliteit, is het noodzakelijk te verzamelen van grote hoeveelheden gegevens en Goedkeuringvande kristallen tussen elke pomp laser impuls zorgen. Hier beschrijven we in detail hoe we de extrusie van de bacteriorhodopsin microcrystals geoptimaliseerd voor onze recente TR-SFX experimenten op de Linac Coherent licht bron (LCLS). Het doel van de methode is voor het optimaliseren van 3D-effect voor een stabiele en continue stroom terwijl het handhaven van een hoge dichtheid van kristallen het percentage te verhogen op welke gegevens kunnen worden verzameld in een TR-SFX experimenteren. We bereiken dit doel door het opstellen van lipidic kubieke fase met een homogene verdeling van kristallen met behulp van een roman drieweg spuit koppelinrichting gevolgd door aanpassing van de samenstelling van de steekproef op basis van metingen van de stabiliteit van de extrusie genomen met een high-speed de set-up van de camera. De methode kan worden aangepast aan het optimaliseren van de stroom van andere microcrystals. De setup zal beschikbaar zijn voor gebruikers van de nieuwe faciliteit van de Zwitserse vrije elektron Laser.
Seriële femtoseconde kristallografie (SFX) is een structurele biologie-techniek die gebruik maakt van de unieke eigenschappen van X-ray vrije elektron lasers (XFEL) om te bepalen van de kamertemperatuur structuren uit duizenden kristallen micrometer en middelgrote terwijl outrunning allermeest de schade door straling door de “diffractie vóór vernietiging” beginsel1,2,3.
In een tijd-resolved uitbreiding van SFX (TR-SFX), worden de pulsen van de femtoseconde van de XFEL gebruikt voor het bestuderen van structurele veranderingen in de eiwitten4,5. De proteïne van belang wordt geactiveerd met een optische laser (of een andere activiteit-trigger) vlak voor neergeschoten door de XFEL in een pomp-sonde setup. Door het juist beheersen van de vertraging tussen de pomp en sonde pulsen, kan de doel-eiwit worden vastgelegd in verschillende Staten. Moleculaire films van structurele veranderingen over elf ordes van grootte in tijd tonen de kracht van de nieuwe XFEL-bronnen te bestuderen van de dynamiek van verschillende eiwitten doelen6,7,8,9, 10,11,12,13. Hoofdzakelijk, voegt de methode het dynamische spectroscopische en statische structurele technieken tot een, waardoor een glimp in eiwit dynamiek in de buurt van atomaire resolutie.
Eenvoudige systemen voor TR-SFX kunnen bevatten een endogene trekker van activering met een lichtgevoelig component zoals retinal in109,bacteriorhodopsin (bR), de chromophores in Fotosysteem II12,13, photoactive gele eiwit (PYP)6,7 omkeerbaar photoswitchable TL proteïne11, of een photolyzable koolmonoxide in myoglobine8. Spannende varianten van de techniek nog in ontwikkeling zijn afhankelijk van de mix en injecteren regelingen14,15 te studeren enzymatische reacties of een elektrisch veld gebruikt voor het opwekken van structurele veranderingen16. Gezien het feit dat XFEL bronnen alleen beschikbaar voor een paar jaar zijn en extrapoleren verleden successen in de toekomst, de methode potentieel als een echte game-wisselaar met betrekking tot ons begrip van hoe toont eiwitten functie.
Omdat biologische monsters worden vernietigd door een eenmalige blootstelling aan een hoogvermogen XFEL pulse, waren nieuwe benaderingen van eiwit kristallografie noodzakelijk. Onder deze procedures moest de mogelijkheid om te groeien van grote hoeveelheden van uniforme microcrystals ontwikkelde17,18,19. Opdat het verzamelen van de gegevens op een XFEL, moeten deze kristallen worden geleverd, verwijderd en vervolgens vernieuwd voor elke XFEL pulse. Gezien het feit dat XFELs brand bruikbare pulsen bij 10-120 Hz, moet monster levering snel, stabiel en betrouwbaar is, terwijl ook de kristallen intact en beperkend consumptie. Onder de meest succesvolle oplossingen is een hoge viscositeit micro-extrusie injector, die levert een voortdurend streaming kolom van kamertemperatuur crystal-beladen lipidic kubieke fase (LCP) over de gepulste X-ray lichtbundel20. Willekeurig georiënteerde kristallen, ingebed in de LCP-stroom, die worden onderschept door de XFEL pulsen scatter x-stralen op een detector waar een patroon van diffractie is opgenomen. LCP was een natuurlijke keuze voor een monster levering medium zoals het vaak als een groeimedium voor membraan eiwit kristallen17,21,22,23, nog andere informatiedragers hoge viscositeit gebruikt wordt 24,25,26,27,28,29,30 en31 van de oplosbare eiwitten zijn ook gebruikt in de injector. SFX met de hoge viscositeit injector is geslaagd tijdens de structuurbepaling van membraan eiwitten13,32 met inbegrip van G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs)33,34, 35,,36,,37, met voldoende voor inheemse phasing38,39 terwijl zowel tijd als monster efficiënt de kwaliteit van de gegevens. Momenteel, deze injectoren zijn meer routinematig wordt gebruikt voor metingen van de kamertemperatuur op synchrotron bronnen28,30,40,41 , zowel als bij de meer technisch veeleisende TR-SFX experimenten op XFELs9,10,13,42.
Vergelijkbare TR-SFX experimenten zijn uitgevoerd met behulp van andere types van de injector zoals vloeibare fase levering in een stroom mondstuk6,7,12 gericht, echter deze methode vereist proteïne bedragen niet beschikbaar voor velen biologisch interessante doelen. Voor de bepaling van de statische structuren met behulp van een gemiddeld verbruik van 0.072 mg eiwit per 10.000 geïndexeerde diffractie patronen in vergelijking met 9.35 mg voor de vloeibare jet viskeuze extrusie hebben sproeiers gemeld (dat wil zeggen, ongeveer 130 keer meer monster efficiënt)20. De hoge viscositeit injector is gebleken te zijn van een levensvatbare monster levering apparaat voor TR-SFX terwijl slechts enkele van deze steekproef efficiëntie43te offeren. In Nogly et al. (2018)10, bijvoorbeeld monster verbruik was ongeveer 1,5 mg per 10.000 geïndexeerde patronen, die gunstig in vergelijking met soortgelijke TR-SFX experimenten met behulp van de PYP waar gemiddeld monster verbruik veel hoger bij 74 mg eiwit per 10.000 was geïndexeerde patronen6. Hoge viscositeit injectoren hebben dus duidelijke voordelen wanneer is het beperken van de hoeveelheid eiwit beschikbaar of kristallen worden geteeld rechtstreeks in LCP.
Voor TR-SFX met hoge viscositeit injectoren naar de meest betrouwbare gegevens opleveren diverse technische problemen moeten worden aangepakt: de snelheid van de stroming moet blijven boven een minimale kritische waarde; de hit-tarief moet worden gehandhaafd op een niveau dat niet weer langzaam het verzamelen van de gegevens (bijvoorbeeld meer dan 5%); en monster moet worden geleverd zonder overmatige storingen. Ideaal, deze voorwaarden is al voldaan lang voordat een geplande TR-SFX experiment zo efficiënt mogelijk gebruik van de beschikbare tijd van de XFEL. Pricipally, een vertraging in de LCP-stroom kan toestaan indringende kristallen die waren geactiveerd met meer dan één optische laser puls en resultaat in gemengde actief Staten, of indringende verpompte materiaal wanneer umpumped materiaal in de bundel wordt verwacht. Een bijkomend voordeel van injectie pre-test is dat downtime tijdens het verzamelen van de gegevens op een XFEL wordt geminimaliseerd als tijd gedegradeerd tot vervanging van verstopte spuitstukken, wijzigen uit niet-diepte monsters, en andere onderhoudstaken is verlaagd.
Hier presenteren we een methode voor het optimaliseren van monster levering voor het verzamelen van de gegevens van de TR-SFX met een hoge viscositeit micro-extrusie injector. Voor de eenvoud vertrouw de beschreven methoden niet op toegang tot een bron van X-ray, hoewel werk aan een synchrotron beamline29 zou nadere informatie over verwachte hit tarieven en kristal diffractie. Onze protocollen werden ontwikkeld om experimenten te vangen retinale isomerisatie in de protonpomp bacteriorhodopsin10 te optimaliseren en worden uitgevoerd in twee fasen, te beginnen met de voorbereiding van crystal monsters voor extrusie gevolgd door controle van de extrusie met behulp van een high-speed camera setup. In de eerste fase, wordt de crystal-beladen LCP gemengd met extra LCP, lage overgang temperatuur lipiden of andere additieven om ervoor te zorgen dat het uiteindelijke mengsel is geschikt voor bezorging binnen de voorbeeldomgeving zonder verstopping of vertragen. Een nieuwe drieweg spuit koppelstuk werd ontwikkeld ter verbetering van mengen prestaties en monster homogeniteit. De tweede fase bestaat uit een test van de extrusie opgenomen door een high-speed camera naar de extrusie snelheid stabiliteit rechtstreeks te meten. Na de analyse van de videogegevens, aanpassingen kunnen worden aangebracht bij het protocol van de voorbereiding van monster experimentele resultaten te verbeteren. Deze procedures ter voorbereiding van de andere eiwitten voor TR-SFX gegevensverzameling, met minimale wijzigingen, kunnen worden aangepast en zal bijdragen tot het efficiënte gebruik van de beperkte XFEL beamtime. Met nieuwe voorzieningen van de XFEL net beginnen hun werking44,45 en de overdracht van seriële gegevens injector gebaseerde vergaringsmethoden aan synchrotrons28,30,40,41 , de komende jaren zal zeker blijven spannende nieuwe inzicht verwerven in de structurele dynamica van een ooit-grotere verscheidenheid van eiwit doelen.
De TR-SFX-methode met de viskeuze extrusie injector heeft bewezen te zijn van een levensvatbare techniek voor structurele dynamica studies van bacteriorhodopsin9,10 en Fotosysteem II13 en nu lijkt klaar om te studeren eiwitten rijden andere Foto biologische processen zoals ion licht-gedreven vervoer of zintuiglijke waarneming5,50. De hierboven beschreven protocollen werden ontworpe…
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen Gebhard Schertler, Rafael Abela en Chris Milne ter ondersteuning van het gebruik van hoge viscositeit injectoren op de PSI. Richard Neutze en zijn team zijn erkend voor discussies over time-resolved kristallografie en monster levering met behulp van hoge viscositeit injectoren. Voor financiële steun, we erkennen de Zwitserse National Science Foundation voor subsidies 31003A_141235, 31003A_159558 (naar J.S.) en PZ00P3_174169 (tot P.N.). Dit project heeft financiering ontvangen van de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma onder de Marie Sklodowska-Curie subsidie overeenkomst No 701646.
Mosquito LCP Syringe Coupling | TTP labtech store | 3072-01050 | |
Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
7.9 MAG | Avanti Polar Lipids Inc. | 850534O | |
50% w/v PEG 2000 | Molecular Dimensions | MD2-250-7 | |
Paraffin (liquid) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
High speed camera | Photron | Photron Mini AX | |
High magnification lens | Navitar | 12X Zoom Lens System | |
Three axis stage | ThorLabs | PT3/M | |
Fiber light | Thorlabs | OSL2 | |
Fused silica fiber | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
Lite touch ferrule | IDEX | LT-100 | |
ASU high viscosity injector | Arizona State University | Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
HPLC pump | Shimadzu | LC-20AD | |
Electronic gas regulator | Proportion Air | GP1 |