Mejora de extrusión de alta viscosidad de microcristales para Cristalografía de femtosegundo Serial tiempo resuelto en láseres de rayos x

Femtosegundo serial Cristalografía (SFX) es una técnica de biología estructural que explota las propiedades únicas de láseres de electrones libres de rayos x (XFEL) para determinar estructuras de temperatura de miles de cristales de tamaño micrométrico y vencer la mayoría de el daño de la radiación por la “difracción antes de destrucción” principio^1,2,3.

En una extensión de tiempo-resolved de SFX (TR-SFX), los pulsos de femtosegundo del XFEL se utilizan para estudiar cambios estructurales en las proteínas^4,5. La proteína de interés se activa con un láser óptico (u otro disparador de la actividad) justo antes de ser baleado por el XFEL en una configuración de prueba de bomba. Precisamente controlando el retardo entre pulsos de bomba y sonda, la proteína diana puede ser capturada en diferentes Estados. Películas moleculares de cambios estructurales sobre once órdenes de magnitud en tiempo de demuestran el poder de las nuevas fuentes XFEL para estudiar la dinámica de varias proteínas objetivos^{6,7,8,9, 10,11,12,13}. Principalmente, el método se une a las técnicas estructurales espectroscópicas y estáticas dinámicas en uno, proporcionando un vistazo en la dinámica de la proteína en cerca de resolución atómica.

Sistemas simples para TR-SFX pueden contener un activador endógeno de activación con un componente fotosensible como retina de bacteriorhodopsin (bR)^9,10, cromóforos en fotosistema II^12,13, proteínas fotoactivas amarillo (PEP)^6,7 reversible fotoconmutables proteína fluorescente¹¹, o el monóxido de carbono de un photolyzable en mioglobina⁸. Interesantes variaciones de la técnica todavía en desarrollo dependen de la mezcla e inyectan esquemas^14,15 para estudiar reacciones enzimáticas o un campo eléctrico que se utiliza para inducir cambios estructurales¹⁶. Teniendo en cuenta que fuentes XFEL sólo han estado disponibles desde hace unos años y extrapolando más allá de los éxitos en el futuro, el método muestra potencial como un cambio real con respecto a nuestra comprensión de cómo función de las proteínas.

Porque las muestras biológicas se destruyen por una única exposición a una alta energía de pulso XFEL, nuevos enfoques a la cristalografía de proteínas fueron necesarios. Entre estos procedimientos, la capacidad de cultivar grandes cantidades de microcristales uniforme debían ser desarrollados^17,18,19. Para habilitar la recopilación de datos en un XFEL, estos cristales deben ser entregados descarta y entonces renovados por cada pulso XFEL. Dado que XFELs fuego utilizables pulsos de 10-120 Hz, entrega de la muestra debe ser rápido, estable y confiable, manteniendo también a los cristales intacto y limitando el consumo. Entre las soluciones más exitosas es un inyector de micro-extrusión de alta viscosidad, que entrega un contínuamente streaming columna de temperatura ambiente cargado de cristal lipídica cúbico fase (LCP) en todo el pulsado de haz de rayos x²⁰. Cristales orientados al azar, incrustados en la secuencia de la LCP, que son interceptados por la dispersión de pulsos XFEL rayos x en un detector donde se registra un patrón de difracción. LCP fue una elección natural para un medio de entrega de muestra como se utiliza con frecuencia como un medio de crecimiento de membrana proteína cristales^17,21,22,23, otros medios de alta viscosidad del portador ^{24,25,26,27,28,29,30} y³¹ de proteínas solubles se han utilizado también en el inyector. SFX con el inyector de alta viscosidad ha sido exitosa durante la determinación de la estructura de la membrana proteínas^13,32 incluyendo G proteína-juntó los receptores (GPCRs)^{33,34, 35,36,37}, con la calidad de los datos suficiente para nativos fase^38,39 mientras que tiempo y muestra eficiente. Actualmente, estos inyectores se utilizan más habitualmente para la medición de temperatura en sincrotrón fuentes^28,30,40,41 , así como durante la más técnicamente exigiendo experimentos TR-SFX en XFELs^9,10,13,42.

Experimentos de TR-SFX comparables se han realizado con otros tipos de inyector como fase líquida entrega un flujo enfocado boquilla^6,7,12, sin embargo, este método requiere cantidades de proteínas no está disponibles para muchos objetivos biológicamente interesantes. Para la determinación de estructuras estáticas usando extrusión viscoso un consumo medio de 0,072 mg de proteína por patrones de difracción indexadas 10.000 en comparación con mg 9,35 para el chorro de líquido han divulgado los inyectores (es decir, alrededor de 130 veces más muestra eficiente)²⁰. El inyector de alta viscosidad ha demostrado ser un dispositivo de entrega de muestra viable para TR-SFX mientras sólo sacrificar algunas de esta muestra eficacia⁴³. En Nogly et al (2018)¹⁰, por ejemplo, consumo de muestra era alrededor de 1,5 mg por 10.000 patrones indexados, que compara favorable a experimentos similares de TR-SFX con el PEP que consumo de media de la muestra fue mucho mayor con 74 mg de proteína por cada 10.000 patrones indexadas⁶. Inyectores de alta viscosidad así tienen claras ventajas cuando es la limitación de la cantidad de proteína disponible o cristales se cultivan directamente en LCP.

Para TR-SFX con alta viscosidad inyectores para obtener los datos más confiables varias cuestiones técnicas deben abordarse: la velocidad de flujo debe permanecer por encima del valor crítico mínimo; la tasa de éxito debe mantenerse a un nivel que no recopilación de datos lenta (por ejemplo, más de 5%); y la muestra tiene que ser entregado sin interrupciones excesivas. Idealmente, estas condiciones se cumplen ya mucho antes de que un experimento de TR-SFX programado con tiempo disponible XFEL tan eficientemente como sea posible. Pricipally, una desaceleración en el flujo LCP puede permitir cristales que se activan con más de un pulso de láser óptico y resultar en Estados activos mixtos de sondeo o sondeo material bombeado cuando umpumped material se espera que en la viga. Un beneficio adicional de la prueba de inyección es que se reduce al mínimo tiempo de inactividad durante la recogida de datos en un XFEL tiempo relegado a sustitución de inyectores obstruidos, cambio de muestras no-extrudado, y otras tareas de mantenimiento se reduce.

Aquí, presentamos un método para optimizar la entrega de la muestra para la recolección de datos TR-SFX con un inyector micro-extrusión de alta viscosidad. Para simplificar, los métodos descritos no dependen del acceso a una fuente de rayos x, aunque trabajo en un sincrotrón línea²⁹ ofrecerá más información sobre expectativas de tasa de éxitos y de difracción del cristal. Nuestros protocolos fueron desarrollados para optimizar los experimentos para capturar isomerización retiniana en la bomba de protones bacteriorhodopsin¹⁰ y se llevan a cabo en dos fases a partir de preparación de muestras de cristal para extrusión seguido de control de la extrusión usando una configuración de la cámara de alta velocidad. En primera fase, el LCP cargados de cristal se mezcla con LCP adicional, transición baja temperatura lípidos u otros aditivos para asegurar que la mezcla final es conveniente para la entrega en el entorno de muestra sin obstrucción o reducción. Un nuevo acoplador de la jeringuilla de tres vías fue desarrollado para mejorar la homogeneidad mezcla de rendimiento y de la muestra. La segunda fase consiste en una prueba de extrusión grabada por una cámara de alta velocidad para medir directamente la estabilidad de la velocidad de extrusión. Tras el análisis de los datos de vídeo, pueden hacer ajustes en el protocolo de preparación de muestra para mejorar los resultados experimentales. Estos procedimientos pueden ser adaptados para preparar otras proteínas para la recogida de datos TR-SFX, con modificaciones mínimas y contribuirán al uso eficiente del limitado XFEL beamtime. Con nuevas instalaciones XFEL, empezando su funcionamiento^44,45 y la transferencia de métodos de recolección de datos en serie basado en el inyector a sincrotrones^28,30,40,41 , los próximos años seguramente continuará brindando emocionantes nuevas penetraciones en la dinámica estructural de una gama cada vez más amplio de objetivos de proteína.