Miglioramento di estrusione ad alta viscosità di microcristalli per Time-resolved Serial Femtosecond cristallografia a raggi x laser

Seriale a femtosecondi cristallografia (SFX) è una tecnica di biologia strutturale che sfrutta le proprietà uniche dei raggi x laser ad elettroni liberi (XFEL) per determinare le strutture di temperatura ambiente da migliaia di cristalli di dimensioni micrometriche mentre outrunning la maggior parte delle il danno da radiazione della “diffrazione prima distruzione” principio^1,2,3.

In un’estensione di tempo-risolta di SFX (TR-SFX), gli impulsi a femtosecondi dal XFEL sono utilizzati per studiare i cambiamenti strutturali in proteine^4,5. La proteina di interesse viene attivata con un laser ottico (o un’altra attività trigger) appena prima di essere ripresi da XFEL in un’installazione di pompa-sonda. Controllando con precisione il ritardo tra gli impulsi di pompa e sonda, la proteina dell’obiettivo possa essere catturata in Stati diversi. Film molecolare dei cambiamenti strutturali nel corso di undici ordini di grandezza in tempo dimostrare il potere delle nuove fonti XFEL per studiare la dinamica di diverse proteine target^{6,7,8,9, 10,11,12,13}. Principalmente, il metodo unisce le tecniche strutturali con spettroscopiche e statiche dinamiche in uno, fornendo un assaggio nelle dinamiche di proteina a vicino a risoluzione atomica.

Sistemi semplici per TR-SFX possono contenere un trigger endogeno di attivazione con un componente fotosensibile come retinica bacteriorhodopsin (bR)^9,10, i cromofori nel fotosistema II^12,13, proteina gialla fotoattivi (PYP)^6,7 reversibilmente fotomodulabili proteina fluorescente¹¹, o un monossido di carbonio photolyzable in mioglobina⁸. Emozionanti varianti della tecnica ancora in fase di sviluppo si basano su mix e iniettare schemi^14,15 per studiare le reazioni enzimatiche o un campo elettrico usato per indurre cambiamenti strutturali¹⁶. Dato che fonti XFEL sono rese disponibili solo per pochi anni e l’estrapolazione successi del passato verso il futuro, il metodo Mostra il potenziale come un vero e proprio gioco-changer rispetto alla nostra comprensione di come funzione di proteine.

Perché campioni biologici sono distrutti da una singola esposizione a un’ad alta potenza impulso XFEL, nuovi approcci alla cristallografia di proteine erano necessari. Tra queste procedure, la capacità di crescere grandi quantità di microcristalli uniforme doveva essere sviluppato^17,18,19. Per abilitare la raccolta di dati a un XFEL, questi cristalli devono essere consegnati, scartati e poi rinnovati per ogni impulso XFEL. Dato che XFELs fuoco utilizzabili impulsi a 10-120 Hz, consegna del campione deve essere veloce, stabile e affidabile, mantenendo anche i cristalli intatto e limitando il consumo. Tra le soluzioni di maggior successo è un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità, che trasporta un continiously colonna della temperatura ambiente crystal-carico lipidico cubi fase (LCP) in streaming attraverso il pulsato di fascio raggi x²⁰. Cristalli orientati casualmente, incorporate nel flusso di LCP, che vengono intercettati dallo spargimento di impulsi XFEL raggi x su un rivelatore dove si è registrato un pattern di diffrazione. LCP è stata una scelta naturale per un mezzo di consegna del campione, poiché viene frequentemente utilizzata come mezzo di crescita per membrana proteina cristalli^17,21,22,23, ancora altri supporti informatici di alta viscosità ^{24,25,26,27,28,29,30} e³¹ di proteine solubili sono stati utilizzati anche nell’iniettore. SFX con l’iniettore ad alta viscosità è riuscita durante la determinazione della struttura della membrana proteine^13,32 compreso il G proteina-ha accoppiato i ricevitori (GPCR)^{33,34, 36, 35,37}, con qualità di dati sufficiente per nativo phasing^38,39 pur essendo esempio efficiente e tempo. Attualmente, questi iniettori vengono utilizzati più ordinariamente per misure di temperatura al sincrotrone fonti^28,30,40,41 , così come durante il più tecnicamente esigente esperimenti TR-SFX a XFELs^9,10,13,42.

Esperimenti di TR-SFX paragonabili sono stati effettuati utilizzando altri tipi di iniettori come fase liquida consegna in un flusso concentrato di ugello^6,7,12, tuttavia, questo metodo richiede una quantità di proteina non è disponibile per molti biologicamente interessanti destinazioni. Per la determinazione delle strutture statiche mediante estrusione viscoso un consumo medio di 0,072 mg di proteina per diffrazione 10.000 indicizzate rispetto alle 9,35 mg per il getto di liquido ugelli sono stati segnalati (cioè circa 130 volte più campione efficiente)²⁰. L’iniettore ad alta viscosità ha dimostrato di essere un dispositivo di consegna campione valido per TR-SFX mentre solo sacrificare alcuni di questo esempio efficienza⁴³. In Nogly et al (2018)¹⁰, ad esempio, il consumo del campione era circa 1,5 mg per 10.000 modelli indicizzate, che paragona favorevole a simili esperimenti di TR-SFX utilizzando il PYP dove il consumo medio del campione era molto più alto con 74 mg di proteina per 10.000 indicizzata modelli⁶. Iniettori ad alta viscosità sono così evidenti vantaggi quando sta limitando la quantità di proteina disponibile o quando cristalli sono coltivati direttamente in LCP.

Per TR-SFX utilizzando ad alta viscosità iniettori a cedere i dati più affidabili diversi problemi tecnici devono essere affrontate: la velocità di flusso deve rimanere sopra un minimo valore critico; la hit-rate dovrebbe essere mantenuta ad un livello che non esegue il rendering lento di raccolta di dati (ad es., superiore al 5%); e campione deve essere consegnato senza eccessive interruzioni. Idealmente, questi requisiti sono già soddisfatti molto prima che un esperimento di TR-SFX pianificato per utilizzare il tempo disponibile XFEL efficientemente come possibile. Primis, un rallentamento del flusso di LCP può permettere di cristalli che sono stati attivati con più di un impulso laser ottico e risultato in Stati attivi misti di sondaggio sondaggio materiale pompato quando umpumped materiale è previsto nel fascio. Un ulteriore vantaggio dell’iniezione pre-test è che i tempi di inattività durante la raccolta di dati presso un XFEL è ridotta a icona come tempo relegato alla sostituzione ugelli intasati, cambiando i campioni non-espulsione, e altre attività di manutenzione è ridotto.

Qui, presentiamo un metodo per ottimizzare la consegna del campione per la raccolta di dati di TR-SFX con un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità. Per semplicità, i metodi descritti non si basano sull’accesso ad una sorgente di raggi x, anche se lavoro presso un sincrotrone beamline²⁹ sarebbe fornire ulteriori informazioni sui tassi di successo previsti e diffrazione di cristallo. I nostri protocolli sono stati sviluppati per ottimizzare gli esperimenti per catturare isomerizzazione retinica nella pompa protonica bacteriorhodopsin¹⁰ e sono svolte in due fasi a partire con la preparazione dei campioni di cristallo per estrusione seguita monitorando l’estrusione utilizzando un programma di installazione di telecamere ad alta velocità. Nella prima fase, il LCP carichi di cristallo è mescolato con ulteriori LCP, lipidi di transizione bassa temperatura o altri additivi per garantire che la miscela finale è adatta per il recapito nell’ambiente campione senza intasamento o rallentando. Un nuovo coupler siringa a tre vie è stato sviluppato per migliorare la miscelazione omogeneità delle prestazioni e del campione. La seconda fase è costituito da una prova di estrusione registrata da una telecamera ad alta velocità per misurare direttamente la stabilità di velocità di estrusione. In seguito all’analisi dei dati video, possono effettuare regolazioni per il protocollo di preparazione del campione per migliorare i risultati sperimentali. Queste procedure possono essere adattate per preparare altre proteine per la raccolta di dati di TR-SFX, con modifiche minime e contribuiranno all’uso efficiente delle limitate XFEL valutazione. Con nuove strutture XFEL appena iniziando la loro operazione^44,45 e il trasferimento dei metodi di raccolta dati seriale basata su iniettore a sincrotroni^28,30,40,41 , nei prossimi anni saranno sicuramente continuerà a fornire emozionanti nuove intuizioni le dinamiche strutturali di una gamma sempre più ampia di bersagli proteici.