Улучшение экструзии высокой вязкости микрокристаллов для времени решены серийный Фемтосекундный кристаллографии в рентгеновских лазеров

Серийный Фемтосекундный кристаллографии (SFX) является структурной биологии техника, которая использует уникальные свойства свободных электронах рентгеновских лазеров (XFEL) для определения структуры комнатной температуре от тысячи микрометра размера кристаллов при опережающего большую часть излучения ущерб «дифракционный до разрушения» принцип^1,2,3.

В времени решены расширение SFX (TR-SFX) фемтосекундных импульсов от XFEL используются для изучения структурных изменений в белки^4,5. Протеин интереса активируется с оптического излучения (или другого действия триггера) накануне расстрела XFEL в установки насоса зонд. Точно управляя задержку между насоса и датчика импульсов, целевого белка могут быть захвачены в разных государствах. Молекулярные фильмы структурных изменений за одиннадцать порядков в время продемонстрировать мощь новых источников XFEL для изучения динамики нескольких белка цели^{6,,78,9, 10,11,12,13}. Главным образом метод присоединяется к динамической спектроскопические и статические структурные методы в одну, обеспечивая мельком динамики белков в вблизи атомных резолюции.

Простые системы для TR-SFX может содержать эндогенного триггера активации с фото чувствительных компонентов, как сетчатки в бактериородопсин (bR)^9,10, хромофоры фотосистемы II^12,13, фотоактивного желтый белка (Рур)^6,7 обратимо фотопереключаемых флуоресцентный белок¹¹, или окиси углерода photolyzable в миоглобина⁸. Захватывающие вариации техника все еще в развитии полагаться на смеси и внедрить схемы^14,15 для изучения ферментативных реакций или электрического поля используется, чтобы вызвать структурные изменения¹⁶. Учитывая, что XFEL источники были доступны лишь на несколько лет и экстраполяции прошлых успехов в будущем, метод показывает потенциал как реальная игра чейнджер в отношении нашего понимания того, как функция белков.

Поскольку биологические образцы уничтожаются путем одного контакта с высокой мощности XFEL пульс, необходимы новые подходы к кристаллография протеина. Среди этих процедур способность расти большое количество единообразных микрокристаллов необходимо развитых^17,18,19. Чтобы включить сбор данных на XFEL, эти кристаллы должны доставлено, отбрасываются и затем вновь для каждого импульса XFEL. Учитывая, что XFELs огонь полезная импульсов на 10-120 Гц, поставки образца должны быть быстрой, стабильной и надежной, сохраняя также кристаллы нетронутыми и ограничения потребления. Среди наиболее успешных решений — инжектор микро экструзии высокой вязкости, который обеспечивает непрестанно потокового столбца комнатной температуре кристалл Ладена липидный кубической фазы (LCP) через импульсного рентгеновского луча²⁰. Случайным образом ориентированных кристаллах, внедренной в поток LCP, которые перехватываются XFEL импульсов точечных рентгеновских лучей на детектор, где записывается дифракционный рисунок. LCP был естественным выбором для доставки средних образца, как часто используется как средство роста для мембранных белков кристаллы^17,21,22,23, еще других высоковязких перевозчик СМИ ^{24,25,26,27,28,,2930} и³¹ растворимые белки также были использованы в инжектор. Во время определения структуры мембранных белков^13,32 G белка-рецепторы (GPCR)^{33,34, в том числе успешно SFX с высокой вязкостью инжектор 35,,3637}, с качеством данных, достаточных для родной фазирования^38,39 во время как время, так и примеры эффективной. В настоящее время, эти форсунки более регулярно используются для измерения комнатной температуры в синхротрона источников^28,30,40,41 , а также в ходе более технически требуя TR-SFX эксперименты в XFELs^9,10,13,42.

Сопоставимых TR-SFX эксперименты проводились с использованием других типов инжектор как жидкой фазы доставки в потоке сосредоточены сопла^6,7,12, однако, этот метод требует белка суммы не доступны для многих биологически интересных задач. Для определения статического структур с использованием вязких экструзии среднее потребление 0,072 мг белка на 10000 индексированных дифракционные текстуры по сравнению с 9.35 mg для Жидкоструйный насадки были зарегистрированы (то есть, около 130 раз больше образца эффективное)²⁰. Высокая вязкость инжектор было показано, быть жизнеспособными образца доставки устройство для TR-SFX пока только жертвуя некоторые из этого образца эффективности⁴³. В Ногли et al. (2018)¹⁰, например, образец потребления был около 1,5 мг на 10000 индексированных шаблонов, который выгодно отличается от аналогичных TR-SFX экспериментов с использованием PYP, где потребление среднего образца была значительно выше, с 74 мг белка на 10 000 индексированные моделей⁶. Высокая вязкость инжекторов таким образом имеют явные преимущества при ограничении количества белка доступны или когда кристаллы выращивают непосредственно в LCP.

Для TR-SFX с использованием высокой вязкости Инжекторы для получения наиболее достоверных данных несколько технических вопросов необходимо решать: скорость потока должна оставаться выше минимального критического значения; хит ставка должна поддерживаться на уровне, который не отображают медленно сбора данных (например, более чем на 5%); и образец должен быть доставлен без чрезмерных потрясений. В идеале, уже выполнены эти условия задолго до запланированного TR-SFX эксперимент, чтобы максимально эффективно использовать имеющееся время XFEL. Pricipally, замедление в потоке LCP может позволить зондирующего кристаллов, которые были активированы с более чем одной оптической лазерного импульса и результат в смешанных активных государств, или зондирования перекачиваемого материала, когда материал umpumped ожидается в пучке. Дополнительное преимущество инъекций предварительного тестирования, что время простоя во время сбора данных на XFEL свернуто как время отводится для замены засоренные сопла, изменения не прессовать образцы, и другие задачи обслуживания уменьшается.

Здесь мы представляем способ оптимизировать поставки образца для TR-SFX сбора данных с высокой вязкостью микро экструзии инжектор. Для простоты описанных методов не полагайтесь на доступ к источнику рентген, хотя работа Синхротронное излучение²⁹ представит дополнительную информацию на ожидаемые хит ставки и кристалл дифракции. Наши протоколы были разработаны для оптимизации эксперименты для захвата сетчатки изомеризации в Протон насос бактериородопсин¹⁰ и осуществляется в два этапа, начиная с подготовки образцов кристалл для экструзии, следуют контроля экструзии с помощью высокоскоростной камеры установки. На первом этапе кристалл Ладена LCP смешивается с дополнительные LCP, низкой перехода температуры липиды или другие добавки, чтобы убедиться, что окончательный смесь подходит для доставки в демонстрационной среде без забивания или замедления. Новый шприц трехходовой стяжку был разработан для улучшить однородность смешивания производительности и образца. Второй этап состоит из теста экструзии, записанная с помощью высокоскоростной камеры непосредственно измерить стабильность скорости экструзии. После анализа видео данных можно внести изменения протокола Подготовка образца для улучшения экспериментальных результатов. Эти процедуры могут быть адаптированы для подготовки других белков TR-SFX сбора данных, с минимальными изменениями и будет способствовать эффективному использованию ограниченных XFEL beamtime. С новой XFEL зал просто начиная^44,их эксплуатации⁴⁵ и передачи последовательных данных, основанных на инжектор методов сбора synchrotrons^28,30,40,41 , в ближайшие несколько лет несомненно будет продолжать оказывать захватывающее новое понимание структурной динамики все более широкий спектр белковых мишеней.