Summary

וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של Caenorhabditis elegans

Published: March 14, 2019
doi:

Summary

שיטה כמותית פותחה כדי לזהות ולחזות את רעילות חריפה של כימיקלים על-ידי ניתוח באופן אוטומטי את פרופיל פנוטיפי של Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה מתאר כיצד להתייחס תולעים עם כימיקלים בצלחת 384-ובכן, לכידת וידאו, לכמת פנוטיפים קשורים רעילות.

Abstract

החלת בדיקות רעילות של כימיקלים עילאיים הסדר, כגון עכברים או חולדות, היא גוזלת זמן יקר, בשל תוחלת החיים הארוכה שלהם בעיות תחזוקה. להיפך, תולעים נימיות Caenorhabditis elegans (C. elegans) יש יתרונות כדי שזה הבחירה האידיאלית לבדיקת רעילות: אורך קצר, טיפוח קל, יעיל רבייה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור אוטומטית פנוטיפי בניית פרופיל של C. elegans בצלחת 384-. טוב. תולעים נמטודות בתרבית בצלחת 384-טוב עם טיפול כימי ובינוניות נוזלי, קטעי וידאו נלקחים כל הבאר כדי לכמת את ההשפעה הכימית על תכונות תולעת 33. תוצאות ניסויית מדגימים כי התכונות פנוטיפ כימות ניתן לסווג לחזות רעילות חריפה על תרכובות כימיות שונות, ליצור רשימה עדיפות לבדיקות רעילות כימית מסורתי הערכת במודל של מכרסמים.

Introduction

עם התפתחות מהירה של תרכובות כימיות שהוחלה על הייצור התעשייתי ועל חיי היומיום של אנשים, חשוב ללמוד רעילות בדיקת מודלים כימיקלים. במקרים רבים, המודל החייתי מכרסמים הוא מועסק כדי להעריך את פוטנציאל רעילות של כימיקלים שונים על הבריאות. באופן כללי, הקביעה של ריכוזים קטלני (קרי, assayed 50% מנה קטלנית [LD50] של כימיקלים שונים) משמש כפרמטר מסורתי במודל מכרסם (עכברוש/עכבר) אין ויוו, וזה זמן רב ויקר מאוד. בנוסף, בשל הקטן, לחדד, או להחליף את העיקרון (3R) היא מרכזית בעלי חיים רווחה, אתיקה מקצועית, שיטות חדשות המאפשרות עבור ההחלפה של בעלי חיים גבוהים יותר הם בעלי ערך מחקר מדעי-1,2,3 . C. elegans הוא תולעים נימיות אל-אווירני עצמאי אשר היה מבודד מן הקרקע. זה כבר בשימוש נרחב כאורגניזם מחקר במעבדה בשל מאפייניו מועילים, כגון אורך קצר, טיפוח קל, יעיל רבייה. בנוסף, הרבה מסלולים ביולוגיים בסיסיים, כולל תהליכים פיזיולוגיים בסיסיים ותגובות הלחץ ב- C. elegans, נשמרים ב-6,5,4,יונקים גבוהה יותר7 , 8. כמה השוואות אנחנו ואחרים עשו, יש הקונקורדנציה טוב בין C. elegans רעילות רעילות שנצפתה מכרסמים9. כל זה הופך את C. elegans מודל טוב כדי לבדוק את השפעות רעילות כימית ויוו.

לאחרונה, מחקרים לכמת את התכונות פנוטיפי של C. elegans. התכונות ניתן לנתח את רעילות של כימיקלים2,3,10 , הזדקנות תולעים11. גם פיתחנו שיטה המשלבת תולעת נוזלי culturing מערכת, מערכת ניתוח התמונה, שבה התולעים הם בתרבית בצלחת 384-ובכן תחת טיפולים כימיים שונים12. טכניקה זו כמותיים פותחה לנתח באופן אוטומטי את הפרמטרים 33 של C. elegans לאחר 12-24 שעות של טיפול כימי בצלחת 384-ובכן עם המדיום הנוזלי. שלב במיקרוסקופ אוטומטי משמש עבור רכישת וידאו ניסיוני. קטעי וידאו מעובדות על-ידי תוכנית אישית מעוצבת, 33 תכונות הקשורות להתנהגות נע של התולעים הם לכמת. השיטה משמשת כדי לכמת את התולעת פנוטיפים תחת הטיפול של תרכובות 10. התוצאות מציגות כי רעילות שונים יכולים לשנות על הפנוטיפים של C. elegans. אלה פנוטיפים כימות יכול לשמש כדי לזהות ולחזות רעילות חריפה של תרכובות כימיות שונות. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להקל על תצפיות ועל כימות פנוטיפי של ניסויים עם C. elegans בתרבות נוזלי. שיטה זו שימושית עבור היישום של C. elegans הערכות רעילות כימית, פנוטיפ quantifications, אשר מסייעים לחזות רעילות חריפה של תרכובות כימיות שונות וליצור רשימת סדר העדיפויות עבור עוד יותר מסורתי בדיקות הערכת כמות רעילה במודל של מכרסמים. בנוסף, שיטה זו ניתן ליישם רעילות הקרנת ובדיקות של כימיקלים חדשים או המתחם ‘ זיהום הסוכן כתוסף מזון, תרכובות pharmacautical, סביבה אקסוגניים המתחם, וכן הלאה.

Protocol

הפרוטוקול מנחים את טיפול בבעלי חיים של ועדת האתיקה חיה במרכז בייג’ינג למניעת מחלות ובקרה בסין. 1. הכנה כימי להשיג כימיקלים (טבלה 1 ו לטבלה של חומרים). לקבוע את המינון הגבוהים והנמוכים ביותר של כימיקלים בודדים ריכוז מינימלי של 100% הקטלניות (LC100, 24 שעו…

Representative Results

בדקנו על הפנוטיפים של תולעים נחשפים ריכוזים שונים של כימיקלים יותר מ- 1012. במבחן, 33 תכונות שונות היו לכמת עבור כל תרכובת שלוש נקודות זמן (או 12 שעות, 24 שעות ביממה). בעבר, נעשתה השוואה בין מדריך ניתוח אוטומטי של assay תוחלת החיים11,12. זה …

Discussion

היתרונות של C. elegans הובילו השימוש הגובר הרעלים9, הן עבור מחקרים מכניסטית וגישות ההקרנה תפוקה גבוהה. תפקיד מוגבר עבור C. elegans משלימים למערכות אחרות דגם במחקר רעילות הינו יוצא דופן בשנים האחרונות, במיוחד להערכה מהירה רעילות של כימיקלים חדשים. מאמר זה מספק וזמינותו החדש ש?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים CGC על מתבקשים לשלוח את C. elegans. עבודה זו נתמכה על ידי מפתח הלאומית למחקר פיתוח תוכנית של סין (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); קרן מדעי הטבע הלאומית של סין גרנט (#31401025, #81273108 #81641184), בריאות ההון מחקר ופיתוח של פרויקט מיוחד בבייג’ינג (#2011-1013-03), הקרן הפתיחה של בייג’ינג המעבדה מפתח של טוקסיקולוגיה סביבתית (# 2015HJDL03), בסיס מדעי הטבע מחוז שאנדונג, סין (ZR2017BF041).

Materials

2-Propanol Sigma-Aldrich 59300
384-well plates Throme 142761
Agar Bacto 214010
Atropine sulfate Sigma-Aldrich PHL80892
Bleach buffer 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride Sigma-Aldrich 202908
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074
CCD camera Zeiss AxioCam HRm Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Copper(II) sulfate Sigma-Aldrich 451657
Ethanol Sigma-Aldrich 24105
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
K-Medium 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth  10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl 
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 63140
NGM Plate 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone Bacto 211677
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60130
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 795496
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 795488
PPB buffer 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker ZHICHENG ZWY-200D
Sodium chloride Sigma-Aldrich 71382
Sodium fluoride Sigma-Aldrich s7920
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 239305
The link of program https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625
Zeiss automatic microscope  Zeiss AXIO Observer.Z1 Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera

References

  1. Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).
  2. Boyd, W. A., et al. A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay. Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).
  3. Boyd, W. A., Williams, P. L. Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests. Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).
  4. Dengg, M., van Meel, J. C. Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).
  5. Schouest, K., et al. Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).
  6. Sprando, R. L., et al. A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media. Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).
  7. Wang, D., Xing, X. Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).
  8. Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).
  9. Li, Y., et al. Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent. Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).
  10. Boyd, W. A., et al. Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay. PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).
  11. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  12. Gao, S., et al. Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).
  13. Moyson, S., et al. Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).
  14. Wang, X., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).
  15. Boyd, W. A., et al. Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits. Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).

Play Video

Citer Cet Article
Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu, C., Jing, H., Zhang, W., Han, G., Flavel, M., Jois, M., Zeng, Y., Han, J. J., Xian, B., Li, G. A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59082, doi:10.3791/59082 (2019).

View Video