Summary

Ein High-Throughput-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis elegans

Published: March 14, 2019
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Summary

Eine quantitative Methode wurde entwickelt, um zu identifizieren und die akute Toxizität von Chemikalien durch die automatisch analysieren die phänotypische Profilierung von Caenorhabditis ElegansVorhersagen. Dieses Protokoll beschreibt die Würmer mit Chemikalien zu behandeln, in einem 384-Well-Platte, Videos aufzunehmen und toxikologischen Verwandte Phänotypen zu quantifizieren.

Abstract

Toxizitätstests von Chemikalien in der höheren Ordnung Organismen, wie Mäusen oder Ratten, die Anwendung ist zeitaufwändig und teuer, wegen ihrer langen Lebensdauer und Wartungsprobleme. Im Gegenteil, der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) hat Vorteile machen es ideal für Toxizitätstests: eine kurze Lebensdauer, einfache Kultivierung und effiziente Reproduktion. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die automatische phänotypischen Profilierung von C. Elegans in einem 384-Well-Platte. Die Fadenwürmer sind kultiviert in einem 384-Well-Platte mit flüssigen Mittel und chemische Behandlung und Videos stammen von jedem Bohrloch zur Quantifizierung des chemischen Einfluss auf 33 Wurm-Funktionen. Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass die quantifizierten Phänotyp-Features können klassifizieren und, die akute Toxizität für verschiedene chemische Verbindungen Vorhersagen und eine Prioritätenliste für weitere traditionelle chemische Toxizität Assessment-Tests in einem Nagetier Modell zu etablieren.

Introduction

Zusammen mit der rasanten Entwicklung von chemischen Verbindungen, die auf industrielle Produktion und Menschen das tägliche Leben angewendet ist es wichtig, die Toxizitätstests Modelle für die Chemie zu studieren. In vielen Fällen ist das Nagetiere Tiermodell eingesetzt, um die mögliche Toxizität von Chemikalien auf die Gesundheit zu bewerten. Im Allgemeinen dient die Bestimmung der tödliche Konzentrationen (d. h., die vermutlich 50 % tödliche Dosis [LD50] verschiedener chemischer Stoffe) als traditionelle Parameter in einem in-vivo, Nager (Ratte/Maus) Modell ist aufwendig und sehr teuer. Darüber hinaus durch die Reduzierung zu verfeinern Sie, oder ersetzen Sie (3R) Prinzip, das den Tierschutz und Ethik im Mittelpunkt steht, neue Methoden, mit denen für der Ersatz von höheren Tieren sind wertvolle wissenschaftliche Forschung1,2,3 . C. Elegans ist eine freilebende Nematoden, die aus dem Boden isoliert wurde. Es wurde weithin als Organismus Forschung im Labor aufgrund seiner vorteilhaften Eigenschaften, wie eine kurze Lebensdauer, einfache Kultivierung und effiziente Reproduktion verwendet. Darüber hinaus sind viele grundlegende biologischer Signalwege, darunter grundlegende physiologische Prozesse und Stressreaktionen in C. Elegans in höheren Säugetiere4,5,6,7 konserviert. , 8. in ein paar Vergleiche wir und andere haben, gibt es eine gute Übereinstimmung zwischen C. Elegans Toxizität und Toxizität bei Nagetieren9beobachtet. All dies macht C. Elegans ein gutes Modell, die Auswirkungen der chemischen Toxizität in vivo zu testen.

Vor kurzem, einige Studien quantifiziert die phänotypische Merkmale von C. Elegans. Die Funktionen können verwendet werden, um die Toxizität von Chemikalien2,3,10 und die Alterung der Würmer11zu analysieren. Wir entwickelten auch eine Methode, die kombiniert einen flüssigen Wurm Kultivierung System und eine Bild-Analyse-System, in dem die Würmer in einem 384-Well-Platte unter verschiedenen chemischen Behandlungen12kultiviert sind. Dieses quantitative Verfahren wurde entwickelt, um die 33 Parameter von C. Elegans automatisch nach 12-24 h chemische Behandlung in einem 384-Well-Platte mit flüssigen Medium zu analysieren. Eine automatisierte Mikroskoptisch dient zur experimentellen Videoerfassung. Die Videos werden von einem maßgeschneiderten Programm verarbeitet, und 33 Funktionen im Zusammenhang mit den Würmern beweglichen Verhalten quantifiziert. Die Methode wird verwendet, um den Wurm Phänotypen unter der Behandlung von 10 Verbindungen zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigen, dass unterschiedliche Toxizitäten der Phänotypen von C. Elegansverändern können. Diese quantifizierten Phänotypen können verwendet werden, zu identifizieren und vorherzusagen, die akute Toxizität von verschiedenen chemischen Verbindungen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Beobachtung und phänotypischen Quantifizierung von Experimenten mit C. Elegans in einer flüssigen Kultur zu erleichtern. Diese Methode eignet sich für den Einsatz von C. Elegans in chemische Toxizität Auswertungen und Phänotyp Quantifizierungen, die helfen, vorherzusagen, die akute Toxizität von verschiedenen chemischen Verbindungen und etablieren eine Prioritätenliste für weitere traditionelle chemische Toxizität Assessment-Tests in einem Nagetier-Modell. Darüber hinaus kann diese Methode auf die Toxizität screening und Erprobung von neuen Chemikalien oder die Verbindung als Lebensmittel Zusatzstoff Agent Verschmutzung, Pharmacautical Verbindungen, ökologische exogene Substanz und So weiter angewendet werden.

Protocol

Das Protokoll folgt den Tierbetreuung Richtlinien der Tier-Ethik-Kommission des Peking-Zentrums für die Prävention und die Kontrolle in China. 1. chemische Aufbereitung Chemikalien (Tabelle 1 und Tabelle of Materials) erhalten. Bestimmen Sie die höchste und die niedrigste Dosierung der einzelnen Chemikalien für eine minimale Konzentration von 100 % Letalität (LC100, 24 h) und eine maximale Konzentration von 100 % Nonlethality (LC0, 24 …

Representative Results

Wir haben die Phänotypen von Würmern ausgesetzt, unterschiedliche Konzentrationen von mehr als 10 Chemikalien12getestet. Im Test waren 33 besondere Merkmale für jede chemische Verbindung zu drei Zeitpunkten (0 h, 12 h und 24 h) quantifiziert. Zuvor erfolgte ein Vergleich zwischen einer manuellen und einer automatischen Analyse eines Lebensdauer Assays11,12. In diesem Test fanden wir, dass Chemikalien und…

Discussion

Die Vorteile von C. Elegans führten zu seiner zunehmenden Verwendung in Toxikologie9, sowohl für mechanistische Studien und Hochdurchsatz-Screening Ansätze. Eine stärkere Rolle für C. Elegans in Ergänzung zu anderen Modellsysteme in der toxikologischen Forschung hat in den letzten Jahren, vor allem für die schnelle Toxizität Bewertung neuer Chemikalien beachtlich. Dieser Artikel enthält eine neue quantitative Hochdurchsatz-Screening von Wurm-Assay Phänotypen in einem 38…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken CGC für Bitte senden den C. Elegans. Diese Arbeit wurde von National Key Research und Development Program of China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705) unterstützt. National Natural Science Foundation of China Grant (#31401025, #81273108, #81641184), die Kapital Gesundheitsforschung und Entwicklung von speziellen Projekt in Peking (#2011-1013-03), die Öffnung-Fonds von der Beijing Key Laboratory der Umwelttoxikologie (# 2015HJDL03), und die naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Shandong, China (ZR2017BF041).

Materials

2-Propanol Sigma-Aldrich 59300
384-well plates Throme 142761
Agar Bacto 214010
Atropine sulfate Sigma-Aldrich PHL80892
Bleach buffer 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride Sigma-Aldrich 202908
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074
CCD camera Zeiss AxioCam HRm Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Copper(II) sulfate Sigma-Aldrich 451657
Ethanol Sigma-Aldrich 24105
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
K-Medium 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth  10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl 
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 63140
NGM Plate 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone Bacto 211677
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60130
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 795496
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 795488
PPB buffer 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker ZHICHENG ZWY-200D
Sodium chloride Sigma-Aldrich 71382
Sodium fluoride Sigma-Aldrich s7920
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 239305
The link of program https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625
Zeiss automatic microscope  Zeiss AXIO Observer.Z1 Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera

References

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Citer Cet Article
Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu, C., Jing, H., Zhang, W., Han, G., Flavel, M., Jois, M., Zeng, Y., Han, J. J., Xian, B., Li, G. A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59082, doi:10.3791/59082 (2019).

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