Summary

一种用自动表型分析预测线虫化学毒性的高通量测定

Published: March 14, 2019
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Summary

通过对线虫表型分析的自动分析, 提出了一种定量鉴别和预测化学品急性毒性的方法。该协议描述了如何在384孔板中使用化学物质处理蠕虫, 捕获视频, 并量化与毒理学相关的表型。

Abstract

对小鼠或大鼠等高阶生物中的化学品进行毒性测试是耗时和昂贵的, 因为它们的寿命长, 维护问题。相反, 线虫具有其优势, 使其成为毒性试验的理想选择: 寿命短、易于栽培、繁殖效率高。在这里, 我们描述了一个协议的自动表型分析的线虫在384孔板。线虫在384孔板中进行液体介质和化学处理, 并对每口井进行视频处理, 以量化化学对33种蠕虫特征的影响。实验结果表明, 量化的表型特征可以对不同化合物的急性毒性进行分类和预测, 并为啮齿类动物模型中的进一步传统化学毒性评价试验确定优先清单。

Introduction

随着化合物在工业生产和人们日常生活中的迅速发展, 研究这些化学品的毒性检测模型具有重要意义。在许多情况下, 使用啮齿类动物模型来评估不同化学品对健康的潜在毒性。一般来说, 在体内的啮齿类动物模型中, 确定致死浓度 (即不同化学品的50% 致死剂量 [ld50]) 被用作传统参数, 这既耗时又非常昂贵。此外, 由于减少、提炼或取代 (3r) 原则, 这对动物福利和伦理至关重要, 允许替换更高动物的新方法对科学研究有价值 123.线虫是一种自由生活的线虫, 已从土壤中分离出来。由于其寿命短、栽培方便、繁殖效率高等优点, 在实验室中得到了广泛的应用。此外, 许多基本的生物途径, 包括基本的生理过程和在线虫的应激反应,高级哺乳动物4,5,6,7被保存,8. 在我们和其他人进行的几次比较中, 在啮齿类动物中观察到线虫毒性和毒性之间有很好的一致性9。所有这些都使线虫成为测试体内化学毒性影响的良好模型。

近年来, 一些研究对线虫的表型特征进行了量化。这些特性可用于分析化学品 2310 的毒性和蠕虫老化11。我们还开发了一种结合液体蠕虫养殖系统和图像分析系统的方法, 在不同的化学处理, 将蠕虫培养在384孔板中12。该定量技术已开发出来, 可在384孔板中进行12-24h 的化学处理后, 自动分析线虫的33个参数。采用自动显微镜级进行实验视频采集。这些视频由定制设计的程序处理, 与蠕虫移动行为相关的33个功能被量化。该方法用于对10种化合物的处理下的蠕虫表型进行量化。结果表明, 不同的毒性能改变线虫的表型。这些量化的表型可用于识别和预测不同化合物的急性毒性。该方法的总体目标是促进液体培养中线虫实验的观察和表型定量。该方法可用于化学毒性评价和表型定量, 有助于预测不同化合物的急性毒性, 并为进一步的传统化合物建立优先清单。啮齿类动物模型中的化学毒性评估试验。此外, 该方法还可作为食品添加剂污染、药理化合物、环境外源化合物等, 应用于新型化学品或化合物的毒性筛选和检测。

Protocol

该协议遵循了中国北京疾病预防控制中心动物伦理委员会的动物护理指南。 1. 化学制剂 获取化学品 (表 1和材料表)。 确定单个化学品的最高和最低剂量, 对蠕虫的最低浓度为100% 杀伤力 (lc100, 24小时), 最大浓度为100% 非杀伤力 (lc0, 24小时)。使用至少6次浓度最高的稀释剂 (表 1)。注: 进行初步蠕虫杀伤力测试9<…

Representative Results

我们已经测试了暴露在超过10种化学物质12的不同浓度下的蠕虫的表型。在测试中, 在三个时间点 (0小时、12小时和 24小时) 对每种化合物的33个不同特征进行了量化。此前, 对人工和寿命分析的自动分析进行了 11、1 2 项比较。在这个试验中, 我们发现化学物质和浓度会影响蠕虫的表型。此方法的概述如<strong class="…

Discussion

线虫的优点导致其在毒理学9中的应用越来越多, 无论是在机械研究还是高通量筛选方法。近年来, 线虫在补充其他毒理学研究模型系统方面的作用显著增加, 特别是在新化学品的快速毒性评估方面。本文为384井板蠕虫表型的高通量定量筛选提供了一种新的方法, 用于化学毒性的自动鉴定和评价。该检测方法是24小时内化学品急性毒性检测的理想选择, 可应用于亚急性毒…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者感谢 cgc 善意地发送了线虫。这项工作得到了中国国家重点研究与发展计划 (#2018YFC1603102、#2018YFC1602705) 的支持;国家自然科学基金授予 (#31401025, #81273108, #81641184), 北京首都健康研究与开发专项项目 (#2011-1013-03), 北京环境毒理学重点实验室开放基金 (#2015 hjdl03), 中国山东省自然科学基金 (zr2017bf041)。

Materials

2-Propanol Sigma-Aldrich 59300
384-well plates Throme 142761
Agar Bacto 214010
Atropine sulfate Sigma-Aldrich PHL80892
Bleach buffer 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride Sigma-Aldrich 202908
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074
CCD camera Zeiss AxioCam HRm Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Copper(II) sulfate Sigma-Aldrich 451657
Ethanol Sigma-Aldrich 24105
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
K-Medium 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth  10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl 
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 63140
NGM Plate 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone Bacto 211677
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60130
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 795496
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 795488
PPB buffer 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker ZHICHENG ZWY-200D
Sodium chloride Sigma-Aldrich 71382
Sodium fluoride Sigma-Aldrich s7920
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 239305
The link of program https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625
Zeiss automatic microscope  Zeiss AXIO Observer.Z1 Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera

References

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Citer Cet Article
Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu, C., Jing, H., Zhang, W., Han, G., Flavel, M., Jois, M., Zeng, Y., Han, J. J., Xian, B., Li, G. A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59082, doi:10.3791/59082 (2019).

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