Summary

Microdialysis de aminoácidos excitatórios durante as gravações de EEG em ratos movimentando-se livremente

Published: November 08, 2018
doi:

Summary

Aqui, descrevemos um método na vivo microdialysis analisar a liberação de aspartato e glutamato no hipocampo ventral de ratos epilépticos e não-epiléptica, em combinação com gravações de EEG. Concentrações extracelulares de aspartato e glutamato podem ser correlacionadas com as diferentes fases da doença.

Abstract

Microdialysis é uma técnica bem estabelecida neurociência que correlaciona as alterações de substâncias neurologicamente activas difusão no espaço intersticial do cérebro com o comportamento e/ou com o resultado específico de uma patologia (por exemplo, convulsões para a epilepsia). Ao estudar a epilepsia, a técnica do microdialysis é frequentemente combinada com a curto prazo ou mesmo a longo prazo vídeo-Eletroencefalografia (EEG de monitoramento para avaliar a frequência de apreensão espontânea, severidade, progressão e clustering). O combinado microdialysis-EEG baseia-se na utilização de vários métodos e instrumentos. Aqui, realizamos na vivo microdialysis e contínua de vídeo-EEG gravação ao monitor glutamato e aspartato de vazão ao longo do tempo, em diferentes fases da história natural da epilepsia em um modelo do rato. Esta abordagem combinada permite o emparelhamento das mudanças na versão do neurotransmissor com estágios específicos do desenvolvimento da doença e da progressão. A concentração de aminoácidos do dialisato foi determinada por cromatografia líquida. Aqui, descrevemos os métodos e as principais medidas de precaução devem tomar durante no vivo microdialysis de estrutura de tópicos-EEG, com particular atenção para a cirurgia estereotáxica, estimulação basal e alto de potássio durante microdialysis, profundidade eletrodo de EEG gravação e análise de cromatografia líquida de alta eficiência de aspartato e glutamato no dialisato. Esta abordagem pode ser adaptada testar uma variedade de drogas ou doenças induzidas por alterações das concentrações fisiológicas de aspartato e glutamato no cérebro. Dependendo da disponibilidade de um ensaio analítico adequado, pode ser ainda mais usado para testar diferentes moléculas solúveis quando empregando gravação de EEG, ao mesmo tempo.

Introduction

Para fornecer insights sobre o comprometimento funcional da mediada por glutamato excitatório e neurotransmissão inibitória gabaérgica, resultando em convulsões espontâneas em epilepsia do lobo temporal (TLE), nós sistematicamente monitorada concentrações extracelulares de GABA1 e depois do curso os níveis de glutamato e aspartato2 por microdialysis no hipocampo ventral de ratos nos vários pontos de tempo da doença natural, ou seja, durante o desenvolvimento e progressão da epilepsia. Aproveitamos o modelo TLE pilocarpina em ratos, que imita a doença com grande precisão em termos de mudanças comportamentais, eletrofisiológicos e histopatológico3,4 e nós correlacionada à concentração do fluído de amino ácidos para suas diferentes fases: fase aguda após o insulto eletrofisiolÃ, a fase de latência, o tempo da primeira convulsão espontânea e a crônica phass5,6,7. Emoldurando as fases da doença foi habilitado pelo acompanhamento a longo prazo de vídeo-EEG e EEG preciso e caracterização clínica de convulsões espontâneas. Aplicação da técnica microdialysis associado com monitoramento de vídeo-EEG a longo prazo permitiu-na propor hipóteses mecanicistas para neuropatologia TLE. Em resumo, a técnica descrita neste manuscrito permite o emparelhamento de alterações neuroquímicas dentro de uma área do cérebro definidos com o desenvolvimento e progressão da epilepsia em um modelo animal.

Dispositivos emparelhados, compostos de um eletrodo de profundidade justaposto a uma microdialysis cânula, muitas vezes são empregados em estudos de investigação de epilepsia onde alterações em neurotransmissores, seus metabólitos ou substratos de energia devem ser correlacionadas com a atividade neuronal. Na maioria dos casos, é utilizado em livremente, comportando-se os animais, mas também pode ser conduzida de forma semelhante em seres humanos, por exemplo, na categoria fármaco-resistente pacientes epilépticos submetidos a investigação de eletrodo de profundidade antes da cirurgia8. Gravação de EEG e coleção do fluído podem ser realizada separadamente (por exemplo, implantar o eletrodo em um hemisfério e o microdialysis sonda em outro hemisfério, ou mesmo realizando o microdialysis em um grupo de animais durante a execução o único EEG em outro grupo de animais). No entanto, os eletrodos de acoplamento para sondas pode ter múltiplas vantagens: simplifica a cirurgia estereotáxica, limita o dano tecidual para apenas um hemisfério (enquanto o outro, deixando intacto, como um controle para estudos histológicos) e homogeneiza os resultados como estes são obtidos a partir da mesma região do cérebro e o mesmo animal.

Por outro lado, a preparação do dispositivo acoplado microdialysis sonda-eletrodo requer habilidade e tempo se for feito em casa. Um podia passar quantidades relativamente elevadas de dinheiro se tiver comprado no mercado. Além disso, quando microdialysis sondas (sonda dicas são tipicamente 200-400 µm de diâmetro e 7 a 12 mm de comprimento)9e eletrodos de EEG (pontas de eletrodo são geralmente de 300 a 500 µm de diâmetro e o tempo suficiente para alcançar a estrutura cerebral de juros10) são acoplado, o dispositivo montado representa um objeto relativamente pesado e volumoso, de um lado da cabeça, que é problemático para animais e propenso a ser perdidos, especialmente quando está ligado a bomba de diálise e o sistema de gravação de EEG de arame duro. Este aspecto é mais relevante em animais epilépticos que são difíceis de lidar e menos adaptável para as sessões do microdialysis. Técnicas cirúrgicas adequadas e cuidados pós-operatórios adequados podem resultar em implantes de longa duração que causam desconforto animal mínimo e devem ser perseguidos por combinatória microdialysis-EEG experimentos10,11, 12.

As vantagens e limitações da técnica microdialysis foram examinadas em pormenor pelos muitos neurocientistas. Sua principal vantagem sobre outras na vivo perfusão técnicas (por exemplo, fluxo rápido push-pull ou perfusão cortical Copa) é um pequeno diâmetro da sonda que cobre uma área relativamente precisa de interesse13,14, 15. Em segundo lugar, a membrana do microdialysis cria uma barreira física entre o tecido e o perfusato; Portanto, substâncias de alto peso molecular não cruzar e não interfiram com a análise de16,17. Além disso, o tecido é protegido contra o fluxo turbulento do perfusato18. Outra vantagem importante é a possibilidade de modificar o fluxo de perfusato para maximizar a concentração do analito no perfusato (ou seja, o processo de microdialysis pode ser bem definido matematicamente e podem ser modificado para produzir alto concentração do analito na amostra)19. Finalmente, a técnica pode ser usada para infundir a drogas ou substâncias farmacologicamente activas no tecido de interesse e para determinar o seu efeito no local da intervenção20. Por outro lado, o microdialysis tem um tempo de resolução limitada (normalmente mais de 1 min devido ao tempo necessário para a coleta de amostras) em comparação com sensores eletroquímicos ou biológicos; é uma técnica invasiva que provoca danos nos tecidos; compromete o equilíbrio neuroquímico no espaço ao redor da membrana devido ao gradiente de concentração contínua de todas as substâncias solúveis que entra o perfusato juntamente com o analito de interesse. Finalmente, a técnica do microdialysis é altamente influenciada pelos limites das técnicas analíticas utilizadas para a quantificação de substâncias no perfusato9,21,22,23 . A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), após derivatização com orthophthaldialdehyde para análise de glutamato e aspartato em amostras biológicas tem sido bem validado24,25,26 , 27 e sua extensa discussão está fora do escopo deste manuscrito, mas os dados produzidos por meio desse método serão descritos em detalhes.

Quando realizado corretamente e sem modificações da composição perfusato, microdialysis pode fornecer informações confiáveis sobre os níveis basais de liberação do neurotransmissor. A maior parte dos níveis basais é provavelmente o resultado das repercussões de transmissor de sinapses9. Porque em muitos casos a simples amostragem do neurotransmissor no espaço extra sináptico não é suficiente para prosseguir os objectivos de uma investigação, a técnica do microdialysis pode ser empregada também para estimular os neurônios ou privá-los de importante íons fisiológicos como K+ ou Ca2 +, de evocar ou evitar a liberação do neurotransmissor.

Alta estimulação K+ é usada frequentemente em neurobiologia para estimular a atividade neuronal, não só em animais acordados, mas também em culturas primárias e organotypic. A exposição de um sistema nervoso saudável para soluções com concentrações elevadas de K+ (40-100 mM) evoca o efluxo de neurotransmissores28. Essa capacidade dos neurônios para fornecer uma liberação adicional em resposta à alta K+ pode ser comprometida em animais epilépticos1 e em outras de29,de doenças neurodegenerativas30. Da mesma forma, o Ca2 + privação (obtida por perfusing soluções livres Ca2 + ) é usada para estabelecer o cálcio-dependente liberação de neurotransmissores mais medidos pelo microdialysis. Geralmente acredita-se que a liberação de Ca2 + dependente é de origem neuronal, Considerando que a liberação de Ca2 + independente origina glia, mas muitos estudos levantarem controvérsia sobre o significado de Ca2 +-medições sensíveis de, por exemplo, glutamato ou GABA9: assim, se possível, é aconselhável apoiar estudos microdialysis com estudos de microsensor, como estes últimos têm maior resolução espacial e os eletrodos permite para se aproximar de sinapses31.

Sobre microdialysis estudos em animais epilépticos, é importante salientar que os dados obtidos da maioria deles dependem de vídeo ou vídeo-EEG, monitoramento de convulsões, ou seja, da ocorrência de sinais e/ou sintomas devido a anormal transitória síncrona ou excessiva atividade neuronal no cérebro32. Existem algumas especificidades de electrographic convulsões em animais de pilocarpina Tratado que devem ser considerados na preparação do experimento. Convulsões espontâneas são seguidas por atividade deprimida com frequentes EEG picos interictais3 e ocorrem em aglomerados33,34. Sham operados não-epiléptica animais podem apresentar convulsão, como atividade35 e, portanto os parâmetros para avaliação de gravações de EEG devem ser padronizada36 e, se possível, o calendário de sessões do microdialysis deve ser bem definido. Finalmente, é altamente recomendável seguir os princípios e normas metodológicas para monitoramento de vídeo-EEG em roedores adultos controle descrito por peritos da Liga Internacional contra epilepsia e sociedade americana de epilepsia em seus relatórios muito recentes37 ,38.

Aqui, descrevemos microdialysis de glutamato e aspartato em paralelo com as gravações de vídeo-EEG a longo prazo em animais epilépticos e sua análise no dialisato por HPLC. Nós enfatizará os passos críticos do protocolo que um deve cuidar para obter melhores resultados.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela Universidade de Ferrara institucional Animal cuidados e Comissão de uso e pelo Ministério da saúde italiano (autorização: D.M. 246/2012-B) em conformidade com as diretrizes descritas nas Comunidades Europeias Directiva do Conselho, de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE). Este protocolo é especificamente ajustado para determinação de aspartato e glutamato no cérebro de rato dialysates obtidas sob controle de EEG do microdialysis sessões em ratos epilépti…

Representative Results

Recuperação de sonda A recuperação média (ou seja, o conteúdo do ácido aminado no perfusato como uma porcentagem do conteúdo em um volume igual de solução frasco) foi 15.49 ± 0,42% a uma taxa de fluxo de 2 µ l/min e 6.32 ± 0,64 a 3 µ l/min por glutamato e 14.89 ± 0,36% a uma taxa de fluxo de 2 µ L/min e 10.13 ± 0,51 em 3 µ l/min para aspartato ao usar a sonda de membrana cuprophane. Se usar a sonda de me…

Discussion

Neste trabalho, mostramos como uma gravação de vídeo-EEG contínua juntamente com microdialysis pode ser executada em um modelo experimental de TLE. Técnicas de gravação de vídeo-EEG são usadas para diagnosticar corretamente as diferentes fases da progressão da doença em animais e a técnica do microdialysis é usada para descrever as alterações na liberação de glutamato que ocorrem no tempo (sem alterações foram encontradas para aspartato em um estudo publicado anteriormente2). Re…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores desejam agradecer a Anna Binaschi, Paolo Roncon e Eleonora Palma à sua contribuição para manuscritos publicados em precedência.

Materials

3-channel two-twisted electrode Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
guide cannula Agn Tho's, Lindigö, Sweden MAB 4.15.IC Material
Resin KK2 Plastik Elettra Sport, Lecco, Italy KK2 Material
Super Attack gel Loctite Henkel Italia Srl, Milano, Italy 2047420_71941 Material
Imalgene-Ketamine Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Xylazine Sigma, Milano, Italy X1251 Material
Isoflurane-Vet Merial, Toulouse, France 103120022 (AIC) Solution
Altadol 50 mg/ ml – tramadol Formevet, Milano, Italy 103703017 (AIC) Solution
Gentalyn 0.1% crm – gentamycine MSD Italia, Roma, Italy 20891077 (AIC) Material
simplex rapid dental cement Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
GlasIonomer CX-Plus Cement Shofu, Kyoto, Japan PN1167 Material
probe clip holder Agn Tho's, Lindigö, Sweden p/n 100 5001 Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA TS1050044FP Material
Valium 10 mg/2 ml – diazepam Roche, Monza, Italy 019995063 (AIC) Material
1 mL syringe with 25G needle Vetrotecnica, Padova, Italy 11.3500.05 Material
rat flexible feeding needle 17G Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150 Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
digital video surveillance system AverMedia Technologies, Fremont, California, USA V4.7.0041FD Equipment
microdialysis probe Agn Tho's, Lindigö Sweden MAB 4.15.1.Cu Material
microdialysis probe Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA S-8010 Material
block heater Grant Instruments, Cambridge, England QBD2 Equipment
stirrer Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy 711 Equipment
infusion pump Univentor, Zejtun, Malta 864 Equipment
fine bore polythene tubing Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA 800/100/100/100 Material
blue tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1002 Material
red tubing adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden 1003 Material
2.5 mL syringe with 22G needle Chemil, Padova, Italy S02G22 Material
vial cap Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic VCA-1004TB-100 Material
septum Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum Material
glass insert with bottom spring Supelco, Sigma, Milano, Italy 27400-U Material
autosampler vial National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy C4013-2 Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit Knauer, Berlin, Germany V7602 Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump Knauer, Berlin, Germany V7603 Equipment
spectrofluorometric detector Shimadzu, Kyoto, Japan RF-551 Equipment
chromatogrphic column Knauer, Berlin, Germany 25EK181EBJ Material
chromatogrphic pre-column Knauer, Berlin, Germany P5DK181EBJ Material
mobile phase solution A 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 Solution
mobile phase solution B 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 Solution
Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
modified Ringer solution composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA Solution
saline 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 Solution
sucrose solution 10% sucrose in distilled water Solution

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Citer Cet Article
Soukupová, M., Falcicchia, C., Lovisari, F., Ingusci, S., Barbieri, M., Zucchini, S., Simonato, M. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (141), e58455, doi:10.3791/58455 (2018).

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