Microdialyse d’acides aminés excitateurs durant les enregistrements EEG en se déplaçant librement des Rats

Pour donner un aperçu de la déficience fonctionnelle d’induite par le glutamate excitateur et la neurotransmission inhibitrice GABAergique, ayant pour résultat des saisies spontanées dans l’épilepsie du lobe temporal (TLE), nous avons systématiquement suivi des concentrations extracellulaires de GABA¹ et plus tard les niveaux de glutamate et l’aspartate² par microdialyse dans l’hippocampe ventral de rats à divers moments de la maladie naturelle du cours, c’est-à-dirependant le développement et la progression de l’épilepsie. Nous avons profité du modèle TLE, pilocarpine chez les rats, qui imite la maladie très précisément en termes de changements comportementaux, électrophysiologique et histopathologiques^3,4 et nous avons une corrélation entre la concentration dialyse aminés acides à ses différentes phases : la phase aiguë après l’insulte épileptogène, la phase de latence, le temps de la première saisie spontanée et la chronique phass^5,6,7. Encadrant les phases de la maladie a été activée par la surveillance à long terme de vidéo-EEG et l’EEG précis et caractérisation clinique des crises spontanées. Application de la technique de la microdialyse associées au contrôle de vidéo-EEG à long terme nous a permis de proposer des hypothèses mécanistiques de neuropathologie TLE. En résumé, la technique décrite dans ce manuscrit permet l’appariement des altérations neurochimiques dans une zone du cerveau définie avec le développement et la progression de l’épilepsie chez un modèle animal.

Couplés, constituées d’une électrode de profondeur juxtaposée à une canule microdialyse, sont souvent employés dans des études de recherche de l’épilepsie où les changements dans les neurotransmetteurs, métabolites ou des substrats énergétiques doivent être corrélée à l’activité neuronale. Dans la grande majorité des cas, il est utilisé en comportement librement les animaux, mais il peut être également effectuée d’une manière similaire à des êtres humains, par exemple, chez des patients épileptiques pharmaco-résistante, objet d’une enquête d’électrode profondeur avant la chirurgie,⁸. Les enregistrement EEG et dialyse collection peuvent être effectués séparément (par exemple, l’implantation de l’électrode dans un hémisphère et la microdialyse sonde dans l’autre hémisphère ou même effectuer la microdialyse dans un groupe d’animaux lors de l’exécution l’EEG seule dans un autre groupe d’animaux). Toutefois, les électrodes de couplage aux sondes peut présenter des avantages multiples : il simplifie la chirurgie stéréotaxique, limite les dommages aux tissus d’un seul hémisphère (tout en laissant l’autre, intact, comme un contrôle pour des études histologiques) et homogénéiser les résultats que ces proviennent de la même région du cerveau et le même animal.

En revanche, la préparation de l’appareil de sonde-électrode microdialyse couplés exige des compétences et le temps si c’est fait maison. On pourrait passer des quantités relativement élevées d’argent si acheté sur le marché. En outre, quand des sondes microdialyse (pointes de test sont généralement de 200 à 400 µm de diamètre et de 7 à 12 mm de long)⁹et des électrodes EEG (extrémités des électrodes sont généralement de 300 à 500 µm de diamètre et assez longtemps pour atteindre la structure du cerveau d’intérêt¹⁰) sont couplé, cet appareil monté représente un objet relativement lourd et encombrant sur un côté de la tête, ce qui est gênant pour les animaux et sujette à être perdu surtout quand il est connecté à la pompe de dialyse et le système d’enregistrement EEG fil dur. Cet aspect est plus pertinent chez les animaux épileptiques qui sont difficiles à manipuler et moins adaptative pour les sessions de microdialysis. Les techniques chirurgicales adéquates et des soins postopératoires appropriés peuvent entraîner des implants de longue durée qui incommode animaux minime et devraient être poursuivis pour des expériences de combinatoire microdialyse-EEG^{10,11, 12}.

Les avantages et les limites de la technique de la microdialyse ont été examinées en détail par de nombreux chercheurs en neurosciences. Son principal avantage sur les autres en vivo perfusion techniques (p. ex., débit rapide push pull ou perfusion corticale coupe) est un petit diamètre de la sonde qui couvre une superficie relativement précise des intérêts^{13,14, 15}. Deuxièmement, la membrane de la microdialyse crée une barrière physique entre le tissu et le perfusat ; par conséquent, les substances de poids moléculaire élevé ne se croisent pas et n’interfèrent pas avec l’analyse^16,17. En outre, le tissu est protégé contre l’écoulement turbulent du perfusat¹⁸. Un autre avantage important est la possibilité de modifier le flux du perfusat pour maximiser la concentration de l’analyte dans le perfusat (c’est-à-dire, le processus de microdialyse peut être bien défini mathématiquement et peuvent être modifié pour le rendement élevé concentration de l’analyte dans l’échantillon)¹⁹. Enfin, la technique peut servir pour infuser les drogues ou les substances pharmacologiquement actives dans les tissus d’intérêt et de déterminer leur effet sur le site de l’intervention²⁰. En revanche, microdialyse a un temps de résolution limitée (généralement plus de 1 min à cause du temps nécessaire pour le prélèvement d’échantillons) par rapport aux capteurs électrochimiques ou biologiques ; C’est une technique invasive qui provoque des lésions tissulaires ; elle compromet l’équilibre neurochimique au sein de l’espace autour de la membrane en raison du gradient de concentration continue de toutes les substances solubles qui pénètre dans le milieu de perfusion avec l’analyte d’intérêt. Enfin, la technique de la microdialyse est fortement influencée par les limites des techniques analytiques utilisées pour la quantification des rejets de substances dans le milieu de perfusion^9,21,22,23 . La chromatographie liquide haute performance (HPLC) après que dérivatisation avec orthophthaldialdehyde pour l’analyse de glutamate et l’aspartate dans des échantillons biologiques a été bien validé^{24,25,26 , 27} et sa discussion approfondie est hors de la portée de ce manuscrit, mais les données produites à l’aide de cette méthode seront décrite en détail.

Lorsqu’effectué correctement et sans modification de la composition du perfusat, microdialyse peut fournir des informations fiables sur les taux de base de la libération des neurotransmetteurs. La plus grande partie des niveaux basales est probablement le résultat de l’effet d’entraînement émetteur du synapses⁹. Car dans bien des cas l’échantillonnage simple du neurotransmetteur dans l’espace synaptique supplémentaire n’est pas suffisant pour poursuivre les objectifs d’une enquête, la microdialyse technique peut être également employée pour stimuler les neurones ou à les priver d’importants ions physiologiques tels que K⁺ ou Ca^{2 +}, afin d’évoquer ou d’empêcher la libération du neurotransmetteur.

Forte stimulation de K⁺ est souvent utilisée en neurobiologie pour stimuler l’activité neuronale non seulement chez les animaux éveillés, mais aussi dans des cultures primaires et organotypique. L’exposition d’un système nerveux sain à des solutions contenant de fortes concentrations de K⁺ (40-100 mM) évoque l’efflux de neurotransmetteurs²⁸. Cette capacité des neurones à fournir une version supplémentaire en réponse à K haute⁺ peut être compromise aux animaux épileptiques¹ et aux autres de^29,de maladies neurodégénératives³⁰. De même, le Ca^{2 +} la privation (obtenue en perfusant les solutions gratuites Ca^{2 +} ) est utilisée pour établir le calcium-dépendante libèrent des neurotransmetteurs plus mesurées par microdialyse. On croit généralement que libération de Ca^{2 +} dépendante est d’origine neuronale, considérant que la libération de Ca^{2 +} indépendante originaire de glia, mais de nombreuses études a soulevé une polémique sur la signification du Ca^{2 +}-mesures sensibles de par exemple glutamate ou GABA⁹: ainsi, si possible, il est conseillé d’appuyer les études microdialyse microcapteur études, car ces derniers ont une résolution spatiale supérieure et les électrodes permet de se rapprocher de synapses³¹.

Concernant microdialysis études chez l’animal épileptique, il est important de souligner que les données obtenues de la plupart d’entre eux comptent sur la surveillance vidéo ou vidéo-EEG des saisies, c’est-à-direde la présence transitoire des signes et/ou symptômes anormaux excessive ou synchrone l’activité neuronale dans le cerveau³². Il y a quelques détails d’électrographiques saisies chez les animaux traité de pilocarpine qui devraient être examiné lors de la préparation de l’expérience. Les crises spontanées sont suivis d’activité déprimée avec fréquentes EEG intercritiques pointes³ et se produisent dans les clusters^33,34. Sham opéré non-épilepsie animaux peut-être présenter des activité de saisie type³⁵ et donc les paramètres pour l’évaluation des enregistrements EEG devraient être normalisés³⁶ et, si possible, le calendrier des sessions de la microdialyse doit être bien défini. Enfin, nous recommandons fortement conformément aux principes et normes méthodologiques pour la surveillance de vidéo-EEG chez les rongeurs adultes de contrôle décrits par les experts de la Ligue internationale contre l’épilepsie et l’American Epilepsy Society dans leurs rapports très récents^{37 ,},³⁸.

Nous décrivons ici la microdialyse du glutamate et aspartate en parallèle avec les enregistrements de vidéo-EEG à long terme chez les animaux épileptiques et leur analyse dans le dialysat par HPLC. On mettra l’accent sur les étapes critiques du protocole qu’on devrait prendre soin de, pour un meilleur résultat.