Detta protokoll ger en kostnadseffektiv metod för att isolera och karakterisera mus primära renal tubulär celler som senare kan vara sub odlas för att bedöma njurfunktion biologiska funktioner ex vivo, inklusive mitokondriell bioenergetik.
Mitokondriell dysfunktion i de renala tubulära epitelcellerna (TECs) kan leda till nedsatt fibros, en viktig orsak till kronisk njursjukdom (CKD). Därför kan bedömer mitokondriefunktion i primära TECs ge värdefull insikt i bioenergetiska status av cellerna, som ger insikt i patofysiologin av CKD. Medan det finns ett antal komplexa protokoll finns för isolering och rening av proximala tubuli hos olika arter, saknar fältet en kostnadseffektiv metod som optimerats för tubulär cell isolering utan behov av rening. Här ger vi en isolering protokoll som möjliggör studier med fokus på både primär mus proximal och distal renal TECs. Förutom kostnadseffektiva reagenser och minimal djur förfaranden som krävs i detta protokoll, isolerade celler upprätthålla höga energinivåer efter isolering och kan vara sub odlade upp till fyra passager, vilket möjliggör kontinuerlig studier. Dessutom bedömer vi använder en hög genomströmning extracellulära flux analyzer, mitokondriell respirationen direkt i de isolerade TECs i en plattan med 96 brunnar som ger vi rekommendationer för optimering av cell densiteten och sammansatta koncentration. Dessa observationer tyder på att detta protokoll kan användas för renal tubulär ex vivo -studier med en konsekvent och väl standardiserad produktion av nedsatt TECs. Detta protokoll kan ha bredare framtida tillämpningar att studera mitokondriell dysfunktion är associerad med njursjukdomar för läkemedelsutveckling eller drogen karakterisering ändamål.
Renal tubulär epitelial (TEC) cellfunktion är starkt förknippat med det övergripande hälsotillståndet i njuren. Patologisk signalering i njuren orsakar den Dedifferentiering av TECs, som spelar en viktig roll i njure fibros och kronisk sjukdom (CKD)1,2. Som en mycket energisk organ är njuren näst efter hjärtat syreförbrukning, främst genom mitokondriell oxidativ fosforylering3. Elektronmikroskopi studier har visat en positiv korrelation av mitokondriell morfologiska förändringar till patologiska händelser i njurtubuli4. Mitokondriell dysfunktion i TECs orsakar nedsatt fibros genom epitelial till mesenkymala övergången5 och defekta fettsyra oxidation6. Fibros är en progressiv nedsatt patologi som resulterar i CKD. Förstå nedsatt TECs energisk status är därför en nödvändighet för att avslöja patofysiologin av CKD.
I den vuxna njur7finns > 20 celltyper. För att studera funktionen av TECs, behövs en primär kultur av nedsatt epitelceller som en plattform för molekylärbiologi applikationer såsom kemiska behandlingar och genetiska manipulationer. Ännu viktigare, kan genetiska manipulationer göras i vivo i möss via genmodifiering eller via AAV gen leverans tekniker8 så att de isolerade primära cellerna skulle redan vara genetiskt manipulerade. Isolering av primära renal tubulär celler från möss9,10, råttor11,12,13, hörntänder14, kaniner15,16och människor17 ,18 har rapporterats med reningssteg ge ren proximala tubulära cellerna. I dessa tidigare publicerade protokoll som fokuserar på isoleringen av proximala tubulära cellerna, utfördes gradient centrifugering och sortering experiment för rening ändamål19. Medan dessa protokoll är värdefulla för att studera proximala tubuli, är de inte tillräckligt när både proximala och distala tubuli behövs studeras. Till exempel har vår studie om den Alport syndromet avslöjat både proximala och distala njurtubuli spelar viktiga roller i sjukdomsprogression20, som alltså båda sorters i njurtubuli bör utredas i kultur. En färsk studie om nedsatt fluor toxicitet visade också att patologiska förändringar ägde rum i både den proximala och distala tubuli21. Därför är detta isolering protokoll utformade och optimerade för både proximala och distala tubulära celler från mus njurarna med en minimal kostnad av reagenser och enkla rutiner. Alternativt kan utredarna fortfarande följa protokollet fram steg 3.1 och lägga till rening steg9 från denna punkt framåt för isolering av ren proximala tubulära cellerna.
De isolerade cellerna presentera hög energisk nivåer och behålla nedsatt epitelial egenskaper efter sub kulturer till 4 passager. Använder en hög genomströmning extracellulära flux analyzer kan bedöma vi mitokondriell respirationen direkt i de isolerade TECs i en plattan med 96 brunnar, vilket leder till ytterligare insikter i cell densiteten optimering. Dessa observationer tyder på att detta protokoll kan tillämpas på renal tubulär ex vivo -studier med en konsekvent och väl standardiserad produktion av nedsatt TECs. En extra betydelsen av detta protokoll är dess genomförbar användning som en hög genomströmning verktyg för ex vivo karakterisering av mitokondriell blockeringar i nedsatt proximala och distala tubulära cellerna. Därför kan det tjäna som en plattform för läkemedelsutveckling eller drogen karakterisering av njursjukdomar.
Vi optimerad ett protokoll som möjliggör effektiv isolering av mus renala tubulära epitelceller (TECs) och visade att cellerna kan vara sub odlade för en extracellulär flux analys att utvärdera mitokondriella respirationen i närvaro av fettsyra- och/eller glukos-baserade substrat. Detta protokoll är utformad för studier med fokus på både proximala och distala tubulära cellerna och fungerar som en ram som man kan bygga mer komplexa experiment för förståelsen av TEC patologi-associerade njursjukdomar. Jämfört med tidigare publicerade protokoll9,10,19, denna metod kräver inte övertoning separationer med lång centrifugering gånger eller ett gott om antikropp användning för sortering och, därför, erbjuder en mer effektiv och optimerad guide för forskare i fältet för renal tubulär metabola. Det finns flera kritiska steg i detta protokoll, inklusive matsmältning, ny samling, och plätering densitet och sammansatta optimering för extracellulära flux analysen.
Att välja rätt typ av kollagenas och optimala koncentrationen är nyckeln till en framgångsrik matsmältningen och dissociation av tubulära cellerna från nedsatt vävnader. Jämfört med andra typer av kollagenaser, innehåller typ 2 kollagenas relativt högre nivåer av proteas aktivitet, kan separera kompakt nedsatt strukturer. För att minimera risken för förorening till följd av en långvarig perfusion och koktiden, var 0,013% typ 2 kollagenas perfusion vid 30 mL/min. Nedsatt kapseln togs bort först efter båda njurarna hade skördats från djuret och övergår i en steriliserad cell kultur huva. Njurarna var hackad i små bitar och fortsatte sin inkubation med 10 mL av matsmältningen buffert för en annan 5 min för en komplett matsmältning och maximal frisättning av tubulära cellerna.
Även om, efter matsmältningen, vävnad suspensionen leds genom ett 70 µm filter för att ta bort mycket stor vävnad bitar, kommer det fortfarande finnas osmält tubuli som passerar genom filtret och bo inom cellsuspensionen och få klädd på kultur skålen. Det tar längre tid än normalt för dessa tubuli att frigöra tubulära cellerna och fäst ordentligt till kultur skålen. Därför är det ganska viktigt att samla cellsuspensionen och centrifugera det att pellets det okopplade tubuli och celler den andra dagen efter cell plätering. Här låg hastighet centrifugeringssteget ytterligare tar bort andra celltyper som är ljusare än tubulära cellerna och möjliggör okopplade tubuli och tubulära cellerna sedimentera.
Identifiering av rätt cell densiteten är det första och viktigaste steget för en framgångsrik extracellulära flux analys. Resultaten visade att 40 000 celler per brunn på en XF96 mikroplattan är idealisk för primära tubulära cellerna i både en fettsyra och en glukos-baserad respiration assay (figur 3 c). I detta protokoll användes isolerade tubulära cellerna för extracellulära flux analysen på passager 1 och 2. De celler som sub odlas för att passage 3, även om de underhålls ett uttryck för de tubulära markörerna (figur 2) och en anständig prestanda i bioenergetik analyserna (figur 3A), och visade minskad basal respiration nivåer jämfört med passage 2 (visas genom att jämföra OCR i panelerna längst till höger i figur 3A till figur 3 c). Denna minskning kan inte påverka väsentligen friska tubulär celler (till exempel sådana som isolerats från unga vildtyp möss). Dock för studier på celler isolerade från CKD musmodeller som redan har en nedsatt mitokondriell andning, kan högre passager av cellerna orsaka en ytterligare minskning av den basala respirationen som skulle påverka resultaten av extracellulära flux analysen. I studierna bedrivs här, cellerna från både passage 1 och passage 2 visade hög basal respiration nivåer. Vi rekommenderar därför efter detta protokoll, med dessa två tidiga passager för mitokondriell respiration studier med celler isolerade från både friska och sjuka djur. Celler från passage 2 bör fortfarande beaktas om passagen 1 sub kulturen inte ger tillräckligt med celler för flux-analysen. Utöver bioenergetik studier visar vår tidigare forskning att primära TECs på passage 3 kan vara mycket användbart för behandlingar med föreningar följt av proteiner och RNA studier (inga data anges). Som sagt, föreslår vi att utredarna använder detta protokoll för att isolera tubulära cellerna noggrant bör välja optimala passagen för olika forskningsansökningar.
Den arbetande principen av den extracellulära flux analysen bygger på samspelet mellan de injicerade föreningarna och de respiration kedja komplex och effekten av uncoupler. Oligomycin är en hämmare av komplex V (ATP synthase) och används för att skilja ATP-länkade syreförbrukning och syreförbrukningen som krävs för att övervinna den regelbundna proton läckan över en mitokondriell inre membranet32. FCCP uncouples syreförbrukning från ATP produktionen genom att störa den mitokondriella membranpotentialen. Det ger således en mätning av maximal andning kapacitet eftersom det kringgår den begränsade kapaciteten på en proton ion efflux av ATP synthase genom att låta en proton transport genom membranet. Antimycin A, en komplex III-hämmare, och rotenon, ett komplex jag blocker, används i kombination för att stänga ner hela mitokondriell respirationen möjliggör en differentiering mellan den mitokondriella vs. icke-mitokondriell syreförbrukningen i cellerna. Dessa föreningar bör alltid titreras för en viss celltyp innan extracellulära flux analysen att fastställa de optimala koncentrationer som ger den optimala OCR-kurvor. Här, rekommenderar vi 1 µM oligomycin, 1 µM av FCCP och 2 µM av Rotenon/antimycin A för extracellulära flux analysen på primära TECs.
Avslutningsvis ger detta protokoll ett enkelt och kostnadseffektivt sätt att isolera nedsatt primära proximala och distala tubulära epitelceller som kan användas för att utvärdera mitokondriella bioenergetik ex vivo. Detta protokoll kan vara användbar i en mängd olika molekylärbiologiska studier för att undersöka den biologiska funktionen av renala tubulära epitelceller, erkänner vi sina begränsningar när du tillämpar det på studier behöver ren proximala eller distala tubuli. Exempelvis studier på Lowe syndromet, en selektiv proximala tubulära dysfunktion33eller studier på distal renal tubulär acidos, en distala tubulära dysfunktion34, skulle kräva en mer sofistikerade protokollet för cell isolering och rening. Men ger för majoriteten av de studier som jämför tubuli vs. glomeruli, och för studier till skärmen potentiella mitokondriell respiration tillsynsmyndigheter i tubulära cellerna i allmänhet, protokollet en genomförbar hög genomströmning strategi. Detta protokoll kan därför ha breda program att studera mitokondriell dysfunktion är associerad med njursjukdomar för drug discovery eller målet validering.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av följande bidragen till Lina A. Shehadeh: National Institute of Health (R56HL132209 och 1R01HL140468) och Miami hjärtat Research Institute.
Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |