マウスの主な腎尿細管上皮細胞の分離と性質、高スループットの細胞フラックスの解析

動物を含むすべての実験は、動物介護制度と NIH のガイドラインに準拠したマイアミ大学使用委員会によって承認されました。 1. プレートのコーティングと試薬の調製 コラーゲン コーティングを準備します。 コラーゲンの 35 μ L を追加シングル 60 mm のペトリ皿に事前フィルター 20 mM 酢酸溶液 2 mL に。1 時間室温でインキュベート、それを空気乾燥、紫外線にさらします。 コーティングを洗って 3 x 任意の酸性残基を削除し、37 ° C CO2で保存する PBS の-無料の携帯文化のインキュベーター細胞播種の準備ができているまで。コラーゲン コーティングの最終濃度は 5 μ g/cm2です。 灌流のバッファーを準備: 30 mL の PBS にペニシリン-ストレプトマイシン (P/S) の 300 μ L を追加し、分離が開始されるまで 37 ° C の水浴中で混合物を温めます。 消化バッファーを準備: コラゲナーゼ 30 mL に PBS の 2 種類の 3.9 mg を溶解、0.2 μ m ボトル上部フィルターを通してソリューションをフィルター、分離が始まるまで 37 ° C の水浴中でウォーム アップ。 細胞の培養基を準備します。 部屋の温度にサプリメントをもたらします。濾過せず腎の 500 mL にサプリメント (牛胎児血清、上皮成長因子、インスリン、エピネフリン、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、5 μ g/mL と triiodo L 七の 4 pg/mL の 36 ng/mL の 0.5 μ g/mL の 5 μ g/mL の 10 ng/mL の 0.05 mL) を追加します。上皮細胞成長基礎培地 2。 37 ° C の水浴を使用する準備ができるまでのメディアを暖かい。 化合物の準備: 50 mM FCCP の準備、50 ミリメートル etomoxir、50 mM の L-カルニチン、10 mM アンチマイシン A 10 mM オリゴマイシン 10 mM ロテノン、DMSO、分注ですべてのソリューションを株式、-20 ° C の化合物を格納 パルミチン酸ナトリウム 2.5 mM 150 mM NaCl 水溶液の 220 ml を準備し、パルミチン酸を完全に溶解するまでに 75 ° C の水浴のソリューションを温めます。 ウシ血清アルブミン (BSA) の準備: 150 mM の NaCl の 250 mL の無脂肪 BSA を 0.34 mM を準備します。BSA の制御は、次のステップ 1.8 で準備できるパーム BSA ソリューションのネガティブ コントロールとして機能します。 BSA (パーム BSA) にパルミチン酸を共役します。 それがまだ熱い間、パルミチン酸ソリューションを BSA 溶液に徐々 に追加します。PH 7.4 に調整し、活用を完了する、少なくとも 1 h 37 ° C でそれらをミックスします。 接合が完了すると、150 mM の NaCl の別の 150 mL をソリューションに追加、それを混ぜるし、因数-20 ° C で保存最終的な解決策は、1 mM ナトリウムのパルミチン酸と 0.17 mM の BSA を含み、脂肪酸系細胞フラックス法で細胞の脂肪酸基板として使用されます。 細胞外のフラックス測定基底メディアを準備します。 オートクレーブ dH2O の 1 L に DMEM パウダー 1 袋・ 200 mm L-グルタミン (最終的な 4 mM) 20 mL を追加し、軽く混ぜます。 生体エネルギー実験の日、グルコースや脂肪酸ベースの呼吸の試金で使用される細胞外フラックス アッセイ メディアの以降準備のため準備された基底メディアに 100 μ M ナトリウム ピルビン酸を追加します。 ブドウ糖ベースのメディアを準備します。 解糖系を介して細胞呼吸容量を計測するには、1.9 の手順で上記基底メディアに 17.5 mM グルコース パウダー、100 μ M 制御 BSA (として 1.7 の手順で説明)、(脂肪酸の酸化を抑制する) に 20 μ M の etomoxir を追加します。 37 ° C でメディアを温める、pH 7.4 に調整細胞フラックス試金で使用されるまで、37 ° C の水浴中保管してください。 脂肪酸ベースのメディアを準備します。 脂肪酸酸化による細胞の呼吸容量を計測する追加 10 mM 2 D ブドウ糖粉末 (グルコースの解糖系を阻害するアナログ)、100 μ M 基底メディアに L-カルニチンが 1.9 の手順で上記パーム-BSA (に記載されているステップ 1.8) として、100 μ M。 37 ° C でメディアを温める、pH 7.4 に調整細胞フラックス試金で使用されるまで、37 ° C の水浴中保管してください。 2. 血流、消化とマウスの腎臓の収穫 イソフルラン フローとマウスを麻酔し、仰臥位でそれを修正します。分離のみ開始後動物を失いその立ち直り反射、麻酔の深さが前に、と手順22における非外科的鉗子を使用してピンチの評価によって監視されていることを確認します。 毛皮、腹部領域にマウスの胸の脱毛クリームを使用してを削除、ヨウ素を殺菌してヨウ素残留。 胸の切開をする、全腹部領域を開くには切り傷、心臓や腎臓を公開します。 32 mL/分で灌流ポンプを設定し、灌流を開始する前にチューブの任意の泡を削除します。 バッファーがいっぱい心にすぐに心尖を左心室に 27 G 針を挿入し、灌流バッファー心臓のポンプとしても流通して、最終的に右心房の出口から削除を取得しますので、出口を作成する右房内を突きます。 灌流後、30 mL/分消化のためにポンプの速度を切り替えます。 消化の 20 mL の後にバッファーは頂点を通して灌流、尿細管細胞分離の両方の腎臓を摘出します。 3. ティッシュの処理とプライマリ尿細管細胞分離 腎カプセルを外し、髄質、小さな断片に両方の腎臓をミンチ、10 mL の 5 分の緩やかな回転と 37 ° C のオーブンで消化バッファーにそれらを孵化させなさい。 70 μ m のフィルターを通してバッファーを渡すことによって、未消化の腎組織を削除します。消化を停止する培地 10 mL を追加します。 尿細管細胞を収集するには、最初のペレットを収集するために 5 分間 50 x g でフィルター処理された細胞懸濁液を遠心します。上清を新しいチューブに転送し、2 番目のペレットに収集されますすべての尿細管細胞を確保するため 5 分間 50 × g で遠心分離培地 5 mL を追加します。遠心分離は主に重い尿細管をペレットに低い速度では。その後、セルは分離から回復後、純粋な管状文化は、サブの文化の中に高速で遠心は。 20 mL の培地で最初のペレットを再懸濁し、3 番目のペレットを収集するために 5 分間 50 × g で遠心分離機します。 1 mL の培地で 2 番目と 3 番目のペレットを再懸濁します。トリパン ブルーの 10 μ L 細胞懸濁液のミックス 10 μ L は、チャンバー A カウントのスライドとのレコード自動から細胞生存細胞カウンター (材料の表を参照してください) に混合物をロードします。 シングル 60 mm ディッシュを7セル (異種集団) を 10 までシード コラーゲンでプレコート、尿細管細胞の一晩を添付します。 4. プライマリ尿細管細胞サブカルチャーとキャラクタリゼーション 分離後の 1 日目、文化メディアを収集し、任意の浮動の細管をペレットに 5 分間 50 × g で遠心分離機します。上澄みを除去し、新鮮な培地と同じ培養皿にプレートの 4 つの mL で細胞ペレットを再懸濁します。 分離の後の 4 日目、古い培地を削除し、新鮮なメディアを追加します。 分離後 7 日、37 ° c 反応を停止し、5 分間 250 × g で遠心分離によって細胞を収集する文化メディアの 5 分追加 3 mL の 0.25% トリプシン-EDTA の 2 mL でそれらの孵化によってセルをデタッチします。 サブカルチャー、P0 から P1 の細胞を特徴付けるシード 24 ウェル プレートのウェルあたり 5,000 セルでコーティングされたコラーゲン私前述のよう。 手順 4.4 後、24 h 4 %p1 のセルを修復する 10 分間、PFA は 0.2% とそれらを permeabilize 3 分トリトン X-100 10% ロバ血清 (DS) 室温で 1 時間でそれらをブロックして。 希薄化は 10% で 1: 100 まで次の蛋白質の各 DS: 近位管状マーカー アンジオテンシノーゲン (AGT) とアクアポリン 1 (AQP1);遠位尿細管マーカー E-カドヘリン;メサンギウム マーカー CD90/Thy1;・ マクロファージ マーカー EGF のようなモジュールを含む粘液のようなホルモン受容体-1 (F4/80) やクラスターの分化 68 (CD68) ような 4 ° C で一晩細胞とそれらを孵化 次の日、検出を使用して任意の染色 1: 200 反うさぎ、抗マウスまたは抗ラット蛍光二次抗体 45 分。図 2 aに示すように、マーカーの発現を確認する共焦点顕微鏡画像を取る。 P1 のサブカルチャーの後の 3 日目、4.5 の手順で説明されている管状、メサンギウムとマクロファージのマーカーの染色によるサブカルチャーと P2 で評価のための細胞をデタッチします。図 2 aに示すように、マーカーの発現を確認する共焦点顕微鏡下で染色をイメージします。 P2 のサブカルチャーの後の 3 日目、4.5 の手順で説明されている管状、メサンギウムとマクロファージのマーカーの染色によるサブカルチャーと P3 で評価のための細胞をデタッチします。図 2 aに示すように、マーカーの発現を確認する共焦点顕微鏡下で染色をイメージします。 組織染色を準備します。 野生タイプの冷凍と常温で 1 h Col4a3-/-腎臓スライドを風乾してそれらを修正 4 %pfa で 10 分間は 0.2% とそれらを Permeabilize トリトン X-100 10 分の室温で 1 時間 10% ロバ血清 (DS) とそれらをブロックと。1: 200 で 4.5 の手順に従ってマーカー蛋白に対する抗体を加えて一晩 4 ° C でそれらを孵化させなさい。 次の日は、1: 200 反うさぎ、抗マウスまたは抗ラット蛍光二次抗体と 45 分の任意の染色を検出します。図 2 bおよび2 Cに示すように、マーカーの発現を確認する共焦点顕微鏡画像を取る。 5. ミトコンドリア生体エネルギー測定 20,000 や 30,000、40,000 細胞/ウェルの 96 ウェル マイクロ プレートに培養媒体 100 μ l にシード P1 尿細管細胞でプレコート 5 μ g/cm2コラーゲン私細胞フラックスの試金の前日。 センサー カートリッジの水和のためセンサー カートリッジを持ち上げるし、フィル各校正溶液 200 μ L をプレートのも。慎重にカートリッジをロード校正ソリューションでセンサーが水没するバック。少なくとも 7 使用前に h CO2なし 37 ° C のオーブンでカートリッジを配置します。最良の結果を一晩カートリッジ水和の使用をお勧めします。 混合物の準備: 8 μ M のオリゴマイシン、FCCP、9 μ M (ステップは 1.10 で説明) グルコースと脂肪酸 (に記載されている手順 1.11) 細胞外フラックス アッセイ メディアの両方で 20 μ M ロテノン/アンチマイシン A の混合物を準備します。 メディアの変更: 細胞の培地を吸引、グルコースや脂肪酸の分析メディアの 175 μ L を追加 (は化合物に依存して、働いているを参照してくださいステップ 5.3)、37 ° C CO2で 1 時間インキュベートするそれらと -無料インキュベーター。 次の化合物の 25 μ L でカートリッジ ポートをロード: 1 μ M の最終的な集中を達成するためにポート A の 8 μ M のオリゴマイシン (注: それぞれはよく、メディアの 175 μ L が含まれる、ように化合物は希釈 8 になる x)、9 μ M 1 の最終的な集中を達成するためにポート B で FCCPΜ M (注: メディアの 175 μ L プラス 25 μ L 注入ポート A からソリューションのそれぞれが含まれますも、化合物希薄 9 が表示されます x)、20 μ M ロテノン/アンチマイシン A ポート C 各化合物 (注 2 μ M の最終的な集中を達成するために: 各はよくメディアの 175 μ L 加え、ポート A と B から注入溶液 50 μ L を含んでいるが、化合物は希釈 10 になる x)。 ポート D のすべての井戸と背景の井戸 (セルの) の他のすべてのポートに水を追加します。37 ° C CO2のカートリッジを孵化させなさい-10 分のための無料のインキュベーター。 細胞外フラックス アナライザーとコント ローラーを入れます。 アナライザー ソフトウェアを開き、次のプロトコルを入力します。 標準的な測定法を選択します。分析ウィザードを押します。化合物] タブを使用して、化合物のレイアウトを割り当てるし、グループおよびラベルタブを使用して、実験グループにラベルを付けます。背景として (セル) を持たない空の井戸を割り当ててください。 [プロトコル] タブで、利用可能なコマンドを使用して表 1に示されているように次のミックスとメジャーのサイクルを設定: キャリブレーション、2 分のミックス、2 分待って、3 分のための測定 (サイクルを繰り返すこの 2 〜 3 倍)。ポートは、2 分のミックスを注入、2 分、3 分のための測定を待つ (繰り返しこのサイクル 2-3 x);ポート B を注入、ミックス 2 分、2 分、3 分のための測定を待つ (繰り返しこのサイクル 2-3 x);ポート C を注入、ミックス 2 分、2 分、3 分のための測定を待つ (このサイクルを繰り返して 2 3 倍)。エンド ウィザードを押します。また、将来の使用の現在のテンプレートを保存することが可能です。 キャリブレーションを開始する開始を押してください。アナライザーは、自動的にプレート ホルダーを取り出し、挿入されるカートリッジ プレートを要求します。 (通常は 20-25 分) に校正手順が終わったら、セル板にカートリッジ プレートを変更し、実行を続行するプロンプト コマンドを押します。 実行が完了すると、データを転送し、96 ウェル プレートを削除します。それぞれの試金井戸のヘキスト (1:1, 000) を追加し、37 ° C で 5 分間インキュベートします。355 nm 励起と 460 nm の発光を読んでヘキスト蛍光測定による細胞数に OCR データを正規化します。