Yalıtım, karakterizasyonu ve yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analiz fare birincil Renal tübüler epitel hücresi

Tüm deney hayvanları içeren kurumsal hayvan bakım ve kullanım NIH yönergelere uygun Komitesi Miami Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. levha kaplama ve reaktifler hazırlanması Kollajen kaplama hazırlayın: Kollajen 35 μL ekleyin ben 2 mL tek 60mm Petri kabına üzerine önceden filtre uygulanmış 20 mM asetik asit çözeltisi için. 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya, bu kurumasına ve UV için maruz kalmaktadır. Kaplama yıkama herhangi bir asit artıklarını çıkarın ve 37 ° C CO2′ kaydetmek için PBS ile 3 x-kadar hücreleri tohum için hazır boş hücreye kültür kuluçka makinesi. Kollajen kaplama son konsantrasyonu 5 μg/cm2′ dir. Perfüzyon arabellek hazırlamak: PBS için 30 mL penisilin-streptomisin (P/S) 300 μL ekleyin ve yalıtım başlayana kadar bir 37 ° C su banyosunda karışımı sıcak. Sindirim arabellek hazırlamak: 3,9 mg, collagenase tip 2 30 mL içine PBS çözülür, çözüm 0,2 mikron şişe-ilk filtre ile filtre ve yalıtım başlayana kadar 37 ° C’de bir su banyosunda sıcak. Hücre kültür ortamı hazırlayın: Takviyeleri oda sıcaklığına getirmek. Filtrasyon, ek (0.05 mL fetal buzağı serum, epidermal büyüme faktörü, insülin, epinefrin, 36 ng/mL hidrokortizon, transferrin 5 μg/mL ve triiodo-L-thyronine 4 pg/mL 0.5 μg/mL 5 μg/mL 10 ng/mL) 500 mL için böbrek ekleyin epitel hücre büyüme bazal Orta 2. Medya kullanmaya hazır olana bir 37 ° C su banyosunda ısıtın. Bileşikler hazırlamak: 50 mM FCCP hazırlamak, 10 mM rotenon, 10 mM oligomycin, 10 mM antimycin A, 50 mM L-karnitin ve 50 mM etomoxir DMSO, aliquot tüm çözümlerinde onları stok ve -20 ° C’de bileşikleri depolamasını 2.5 mM sodyum palmiat 220 mL 150 mM NaCl çözeltisi hazırlamak ve palmiat tamamen eriyene kadar bir 75 ° C su banyosunda çözüm ısın. Sığır serum albumin (BSA) hazırlamak: 0,34 mM BSA 150 mM NaCl 250 ml yağsız hazırlamak. Denetim BSA takip adım 1.8 hazırlanabilir palm-BSA çözüm için bir negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. BSA (Palm-BSA) için palmiat eşlenik: Hala sıcakken palmiat çözüm BSA çözüm içine yavaş yavaş ekleyin. O zaman, pH 7.4 için ayarlamak ve bunları konjugasyon tamamlamak en az 1 h için 37 ° C’de karıştırın. Konjugasyon tamamlandığında, başka bir 150 mL 150 mm NaCl ekleyin, iyice karıştırın ve aliquots-20 ° C’de kaydetme Nihai çözüm ve yağ asidi substrat hücreleri ekstrasellüler akı yağ asidi tabanlı tahlil için kullanılan 1 mM sodyum palmiat ve 0.17 mM BSA içerir. Hücre dışı akı tahlil bazal medya hazırlayın: 1 DMEM toz torba ve 200 mm L-glutamin (4 mM son) 20 mL 1 litre autoclaved dH2O ve onları hafifçe karıştırın. Bioenergetics deneme günü, 100 µM sodyum pyruvate glikoz – veya yağ asidi – tabanlı solunum assay olarak kullanılmak üzere hücre dışı akı tahlil medya sonraki hazırlıkları için hazırlanan bazal medya ekleyin. Glikoz tabanlı medya hazırlayın: Hücresel solunum kapasitesi glikoliz yoluyla ölçmek için yukarıda açıklanan adım 1.9 bazal medya 17.5 mM glikoz toz, 100 µM kontrol BSA (adım 1.7 açıklandığı gibi) ve 20 µM etomoxir (yağ asidi oksidasyon etkisizleştirmek için) ekleyin. Medya 37 ° C’de ısınmak, pH 7.4 için ayarlamak ve bir hücre dışı akı tahlil kullanılana kadar 37 ° C su banyosu içinde saklayın. Yağ asidi tabanlı medya hazırlayın: Hücresel solunum kapasitesi yağ asidi oksidasyon yoluyla ölçmek için eklemek 10 mM 2D-glikoz toz (glikoz glikoliz etkisizleştirmek için analog), 100 µM Palm-BSA (olarak açıklandığı adım 1.8) ve 100 µM L-karnitin bazal medya için yukarıda açıklanan adım 1.9. Medya 37 ° C’de ısınmak, pH 7.4 için ayarlamak ve ekstraselüler akı tahlil kullanılana kadar 37 ° C su banyosu içinde saklayın. 2. perfüzyon, sindirim ve hasat böbrekler üzerinden fareler Fare bir isoflurane akışı ile anestezi ve sırtüstü pozisyonda düzeltebilirim. Yalıtım sadece hayvan iyileştiren onun refleksleri kaybeder ve anestezik derinlik çimdik değerlendirmeler öncesi ve sırasında yordamı22atravmatik forseps kullanarak tarafından izlenen sonra başlar emin olun. Kürk, fare göğüs, karın bölgesi için depilatory bir krem kullanarak çıkarın, iyot ile dezenfekte ve iyot kalıntısı silin. Göğsünden bir kesi yapmak, bütün karın bölgesi açmak için deriyi kesme ve kalp ve böbrekler bulaşmasına neden. Herhangi bir kabarcıklar perfüzyon başlamadan önce boru kaldırmak ve perfüzyon pompa 32 mL/dk ayarlayın. En kısa zamanda arabellek kalbini doldurur ve kalp tepe ile sol ventrikül 27-G iğne yerleştirin ve perfüzyon arabellek kalp pompa dolaşır ve sonunda sağ atrium çıkışından kaldırılır bir çıkış oluşturmak için sağ atrium poke. Perfüzyon sonra pompa hızı 30 mL/dk sindirim için geçiş yapın. Sindirim arabelleği 20 mL ile apex periosteum sonra her iki böbrek tübüler hücre izolasyon için kaldırın. 3. doku işleme ve birincil tübüler hücreler yalıtım Çıkarmak belgili tanımlık renal kapsül ve medulla, küçük parçalar halinde her iki böbrek kıyma ve onları bir sindirim arabellek 5 min için nazik döndürme 37 ° C fırında 10 ml kuluçkaya. Herhangi bir sindirilmemiş böbrek doku arabellek 70 mikron filtreden geçirerek kaldırın. Sindirim durdurmak için kültür ortamının 10 mL ekleyin. Borulu hücreleri toplamak için filtre uygulanan hücre süspansiyon 50 x g ilk Pelet toplamak 5 min için de santrifüj kapasitesi. Yeni bir tüp süpernatant aktarmak ve kültür ortamı, 50 x g tüm tübüler hücreler sağlamak 5 min için de ikinci Pelet toplanır santrifüj 5 mL ekleyin.Santrifüjü öncelikle ağır tübüllerin cips için daha düşük bir hızda olduğunu. Daha sonra hücrelerin izolasyonu iyileştikten sonra saf borulu kültür alt kültürler sırasında daha yüksek bir hızda centrifuged. İlk Pelet kültür ortamının 20 mL resuspend ve 50 x g üçüncü Pelet toplamak 5 min için de santrifüj kapasitesi. İkinci ve üçüncü granül 1 mL kültür ortamının resuspend. Trypan mavi, 10 µL ile hücre süspansiyon Mix 10 µL karışımı bir sayım slayt ve odası kaydı ( Tablo malzemelerigörmek) hücre canlılığı otomatik sayaç hücre A yük. Tohum 107 hücreleri (türdeş olmayan nüfus) tek bir 60 mm çanak üzerine kadar kollajen ile ön kaplamalı ve geceleme eklemek tübüler hücreler izin. 4. alt kültür ve karakterizasyonu birincil tübüler hücreler Gün 1’den sonra izolasyon, Kültür medya toplamak ve 50 x g herhangi bir kayan tübüllerin cips 5 min için de santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 4 ml taze Kültür Medya ve aynı kültür yemek için geri plaka resuspend. Gün 4’den sonra izolasyon, eski kültür ortamını çıkarın ve taze medya ekleyin. Gün 7 yalıtım sonra onları 2 ml % 0.25 tripsin-EDTA 5 dk. Ekle 3 mL tepki durdurmak ve 5 min için 250 x g de Santrifüjü tarafından hücreleri toplamak için kültür ortamının için 37 ° C’de kuluçka hücreleri bağlantısını kesin. Alt kültür ve P0 hücrelerden P1 için karakterize etmek için iyi bir 24-şey plaka üzerine başına tohum 5000 hücre kaplı kollajen ile ben yukarıda açıklandığı gibi. Adım 4.4, sonra 24 saat tamir % 4, P1 hücrelerle PFA 10 dk, permeabilize onları %0,2 ile Triton X-100 3 dk ve oda sıcaklığında 1 h için % 10 eşek serum (DS) ile engellemek. Seyreltik, 1: 0 10 için DS, her biri aşağıdaki proteinler: proksimal tübüler işaretleri angiotensinogen (AGT) ve aquaporin 1 (AQP1); distal borulu işaret E-cadherin; mesangial işaret CD90/Thy1; ve makrofaj işaretleri EGF benzeri modülü içeren müsin gibi hormon reseptör-1 (F4/80) ve küme farklılaşma 68 (CD68) gibi ve onları gecede 4 ° C’de hücrelerle kuluçkaya Ertesi gün, herhangi bir boyama kullanarak tespit 1: 200 Anti-tavşan da anti-fare Anti-sıçan floresan ikincil antikorlar 45 dk için. Ifade veri işaretleyicilerini, onaylamak için confocal mikroskobu altında görüntü Şekil 2Agösterildiği gibi al. Gün 3 sonra P1 alt kültür, bir alt kültür ve P2, karakterizasyonu için hücreleri boyama bir 4.5 adımda açıklanan borulu, mesangial ve makrofaj işaretleri bağlantısını kesin. Ifade veri işaretleyicilerini, onaylamak için confocal mikroskobu altında Şekil 2Agösterildiği gibi boyama görüntü. Gün 3 sonra P2 alt kültür, alt kültür ve karakterizasyonu, P3 için hücreleri 4.5 adımda açıklanan borulu, mesangial ve makrofaj işaretleri boyama tarafından bağlantısını kesin. Ifade veri işaretleyicilerini, onaylamak için confocal mikroskobu altında Şekil 2Agösterildiği gibi boyama görüntü. Doku boyama hazırlayın: Dondurulmuş yaban tipi ve oda sıcaklığında 1 h Col4a3- / – böbrek slaytlarını kurumasına ve bunları düzeltmek %4 ile 10 dakika süreyle PFA ile % 0,2 onları Permeabilize Triton X-100 10 dk için ve % 10 eşek serum (DS) Oda sıcaklığında 1 h ile engellemek. 1: 200, 4.5. adımda açıklanan marker proteinler karşı antikor ekleyin ve onları gecede 4 ° C’de kuluçkaya. Ertesi gün, herhangi bir 1: 200 Anti-tavşan da anti-fare Anti-sıçan floresan ikincil antikorlar için 45 dk ile boyama algılamak. Görüntüler ifade işaretleri, onaylamak için confocal mikroskop altında rakamlar 2B ve 2 Cgösterildiği gibi tutar. 5. mitokondri Bioenergetics tahlil Tohum P1 tübüler hücreler 20.000, 30.000 veya 100 μL 96-şey Mikroplaka üzerine kültür ortamının bir kuyu başına 40.000 hücreleri ön kaplamalı 5 μg/cm2 kollajen ile ben bir gün önce hücre dışı akı deneyleri. Sensör kartuş hidrasyon, sensör kartuşu kaldırın ve her doldurmak iyi bir kalibrasyon çözüm 200 μL plakalı. Dikkatle kartuş yük geri kalibrasyon çözüm sensörler daldırın. CO2 için en az 7 kullanılmadan önce s olmadan 37 ° C fırında kartuşu yerleştirin.En iyi sonuçlar için gecede kartuş hidrasyon önerilir. Bileşikleri hazırlamak: 8 µM oligomycin, 9 µM FCCP ve 20 µM Rotenon/antimycin A karışımı (1,10 adımda anlatılan) glikoz ve yağ asidi (açıklandığı adım 1.11) hücre dışı akı tahlil ortam hazırlamak. Medya değiştirme: hücre kültürü medya Aspire edin, 175 µL glikoz veya yağ asidi tahlil medya ekleyin (bağımlı olan bileşik, çalışmış olmak görmek adım 5.3) ve onları 37 ° C CO21 h için kuluçkaya-özgür kuluçka makinesi. Aşağıdaki bileşiklerin 25 µL kartuş çıkışıyla yük: 1 µM son bir konsantrasyon elde etmek bağlantı noktası A için 8 mikron oligomycin (Not: her şey medya 175 µL içerir gibi bileşik seyreltilmiş 8 alırsınız x), 9 mikron 1 son bir konsantrasyon elde etmek için FCCP bağlantı noktası B µM (Not: her de içeren medya 175 µL artı 25 µL–dan A bağlantı noktası enjekte çözüm olarak bileşik seyreltilmiş 9 alırsınız x) ve 20 µM Rotenon/antimycin A 2 µM her bileşik (Not için son bir konsantrasyon ulaşmak için Port C : her de içeren medya 175 µL artı 50 µL A ve B noktalarından enjekte çözüm olarak bileşik seyreltilmiş 10 alırsınız x). Su D bağlantı tüm wells ve arka plan Wells (hücreler) diğer tüm bağlantı noktaları ekleyin. 37 ° C CO2kartuşta kuluçkaya-10 min için özgür kuluçka makinesi. Hücre dışı akı analyzer ve denetleyici açın. Analyzer yazılımı açın ve aşağıdaki protokol giriş: Standart tahlilseçin. Tahlil Sihirbazıtuşuna basın. Bileşikler sekmesini kullanarak, bileşik düzen atayabilir ve deneysel grupları etiketlemek için gruplar ve Etiketler sekmesini kullanın. Arka plan olarak boş wells (olmadan hücreleri) atamak unutmayın. İletişim kuralı sekmesi altında Tablo 1′ de gösterildiği gibi kullanılabilir komutlar kullanarak aşağıdaki mix ve ölçü birimi çevrimleri ayarla: kalibre, mix 2 min için 2 dk bekleyin ve 3 dak için ölçü (tekrar bu döngü 2-3 x); bağlantı noktası A, 2 dk için karışımı enjekte, 2 dk, 3 dk için ölçü bekleyin (Bu döngü tekrar 2-3 x); B bağlantı noktası enjekte, karıştırmak için 2 dk, 2 dk, 3 dk için ölçü bekleyin (Bu döngü tekrar 2-3 x); bağlantı noktası C enjekte, karıştırmak için 2 dk, 2 dk, 3 dk için ölçü bekleyin (2-3 x bu döngüsünü tekrarlayın). Bitiş Sihirbazıtuşuna basın. İleride kullanmak için geçerli şablon kaydetmek mümkündür. Kalibrasyon başlatmak için Başlat tuşuna basın. Belgili tanımlık çözümlemek sonra otomatik olarak plaka sahibi çıkarır ve eklenecek kartuş plaka için sorar. Kalibrasyon adım (genellikle 20-25 dk) tamamlandığında, prompt komutunu hücre plakasına kartuş plaka değiştirmek ve Çalıştır devam etmek için tuşuna basın. Çalıştır tamamlandığında, verileri aktarmak ve 96-şey plaka kaldırın. Her tahlil Wells Höchst (1:1, 000) ekleyin ve onları 37 ° C’de 5 min için kuluçkaya 355-nm uyarma ve 460-nm Emisyon okuma Höchst floresans ölçüsü tarafından hücre sayısı için OCR verileri normalleştirmek.