تحليل الجريان خارج الخلية عزل وتوصيف وإنتاجية عالية للماوس الأساسي كلوي أنبوبي الخلايا الظهارية
Summary
يوفر هذا البروتوكول نهج فعال من حيث التكلفة لعزل وتحديد خصائص الماوس الأساسي كلوي أنبوبي الخلايا التي يمكن بعد ذلك شبه مثقف لتقييم الوظائف البيولوجية الكلوي السابقين فيفو، بما في ذلك الاستقلاب المتقدرية.
Abstract
خلل الميتوكوندريا في الخلايا الظهارية الأنبوبي الكلوي (تيكس) يمكن أن تؤدي إلى التليف الكلوي، وسببا رئيسيا لأمراض الكلي المزمنة (كد). ولذلك، قد يوفر تقييم الوظيفة المتقدرية في الابتدائي تيكس نظرة متعمقة في حالة الطاقة البيولوجية للخلايا، وتوفير نظرة ثاقبة في الفسيولوجيا المرضية لكد. في حين هناك عدد من البروتوكولات المعقدة المتاحة لعزل وتنقية من الأنابيب الدانية في الأنواع المختلفة، المجال يفتقر إلى أسلوب فعال من حيث التكلفة الأمثل لعزل الخلية أنبوبي دون الحاجة لتنقية. هنا، نحن نقدم بروتوكولا عزلة التي تسمح للدراسات التي تركز على المرحلتين الابتدائية الماوس تيكس الكلوية القريبة والبعيدة. بالإضافة إلى كواشف فعالة من حيث التكلفة والإجراءات الحيوان الحد الأدنى المطلوب في هذا البروتوكول، الحفاظ على مستويات عالية من الطاقة بعد عزل الخلايا المعزولة ويمكن أن يكون شبه مثقف ما يصل إلى أربعة مقاطع، مما يسمح للدراسات المستمرة. وعلاوة على ذلك، استخدام محلل الجريان خارج الخلية إنتاجية عالية، علينا أن نقيم التنفس المتقدرية مباشرة في تيكس معزولة في صفيحة 96-البئر الذي نحن نقدم توصيات للتحسين من كثافة الخلية وتركيز المركب. وتشير هذه الملاحظات إلى أنه يمكن استخدام هذا البروتوكول للدراسات الأنبوبي الكلوي فيفو السابقين مع إنتاج تيكس الكلوي متسقة وموحدة جيدا. قد يكون هذا البروتوكول أوسع التطبيقات المستقبلية لدراسة خلل mitochondrial المرتبطة باضطرابات الكلي لاكتشاف المخدرات أو لأغراض تحديد خصائص المخدرات.
Introduction
وظيفة الخلية الظهارية الأنبوبي الكلوي (TEC) يرتبط ارتباطاً قويا بالحالة الصحية العامة للكلى. الإشارات المرضية في الكلي يسبب ديديفيرينتييشن تيكس، الذي يلعب دوراً رئيسيا في التليف الكلي والكلى المزمن المرض (كد)1،2. كهيئة نشطة جداً، الكلي الثاني فقط للقلب في استهلاك الأكسجين، أساسا من خلال الفسفرة المتقدرية3. كشفت دراسات المجهر الإلكتروني وجود ترابط إيجابي المتقدرية التغيرات المورفولوجية للأحداث المرضية الكلوية4. خلل mitochondrial في تيكس تسبب التليف الكلوي خلال المرحلة الانتقالية الظهارية للوسيطة5 و أكسدة الأحماض الدهنية المعيبة6. التليف هو علم أمراض كلوية تقدمية التي ينتج عنها كد. ولذلك، فهم حالة نشطة من تيكس الكلوي ضرورة لكشف الفسيولوجيا المرضية لكد.
وهناك أنواع الخلية > 20 في الكلي الكبار7. لدراسة وظيفة تيكس، هناك حاجة إلى ثقافة الأولية للخلايا الظهارية الكلوي كمنصة لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل العلاجات الكيميائية والتلاعبات الجينية. الأهم من ذلك، يمكن أن يتم التلاعب الجيني في فيفو في الفئران عن طريق ترانسجينيسيس أو باستخدام تقنيات إيصال الجينات في إف8 حيث أن الفعل التلاعب الخلايا الابتدائية معزولة وراثيا. عزل خلايا أنبوبي كلوي الأولية من الفئران9،10والفئران11،،من1213والانياب14،15،الأرانب16والبشر17 ،18 تم الإبلاغ عن مع خطوات تنقية تسفر عن خلايا أنبوبية الدانية نقية. في هذه البروتوكولات المنشورة سابقا التي تركز على عزل خلايا أنبوبية الدانية، والطرد المركزي التدرج والفرز تجارب أجريت ل أغراض تنقية19. في حين أن هذه البروتوكولات قيمة لدراسة الأنابيب الدانية، فغير كافية عندما الأنابيب الدانية والبعيدة على حد سواء، تحتاج إلى دراسة. على سبيل المثال، كشفت دراستنا على متلازمة ألبرت الكلوية القريبة والبعيدة على السواء دوراً هاما في تطور المرض20، و ولذلك ينبغي التحقيق في كلا النوعين من الكلوية في الثقافة. وأظهرت دراسة أجريت مؤخرا عن السمية الكلوية فلوريد أيضا أن حدثت تغيرات باثولوجية في كلا من الأنابيب الدانية والبعيدة21. ولذلك، تصميم هذا البروتوكول العزلة والأمثل لخلايا أنبوبية القريبة والبعيدة على حد سواء من الكليتين الماوس بتكلفة أدنى من الكواشف وإجراءات بسيطة. بدلاً من ذلك، يمكن أن المحققين لا يزال يتبع البروتوكول حتى الخطوة 3.1 وإضافة خطوات تنقية9 من هذه النقطة إلى الأمام لعزل خلايا أنبوبية الدانية نقية.
يقدم مستويات عالية حيوية الخلايا المعزولة والحفاظ على الخصائص الظهارية الكلوي بعد الثقافات الفرعية للممرات 4. استخدام محلل الجريان خارج الخلية إنتاجية عالية، نقوم بتقييم التنفس المتقدرية مباشرة في تيكس معزولة في لوحة 96-جيدا، الأمر الذي يؤدي إلى مزيد من الإيضاحات في الخلية كثافة الأمثل. هذه الملاحظات تشير إلى أنه يمكن تطبيق هذا البروتوكول للدراسات الأنبوبي الكلوي فيفو السابقين مع إنتاج تيكس الكلوي متسقة وموحدة جيدا. أهمية إضافية من هذا البروتوكول هو استخدام مجدية كأداة إنتاجية عالية للتوصيف السابقين فيفو الاستقلاب الميتوكوندريا في الخلايا الأنبوبي الكلوي القريبة والبعيدة. ولذلك، يمكن بمثابة منصة لاكتشاف العقاقير أو المخدرات توصيف أغراض اضطرابات الكلي.
Protocol
Representative Results
Discussion
ونحن الأمثل بروتوكول يسمح لكفاءة عزل الماوس الخلايا الظهارية الأنبوبي الكلوي (تيكس) وأظهرت أن الخلايا يمكن أن تكون مثقف الفرعي لتحليل تدفق خارج الخلية لتقييم التنفس المتقدرية حضور الأحماض الدهنية- و/أو الركازات المستندة إلى الجلوكوز. هذا البروتوكول مصمم للدراسات التي تركز على خلايا أنبوبية القريبة والبعيدة على حد سواء، وتعمل كإطار لبناء تجارب أكثر تعقيداً لفهم الأمراض المرتبطة بأمراض الكلي والمجلس التنفيذي الانتقالي. بالمقارنة مع البروتوكولات المنشورة سابقا9،،من1019، هذا الأسلوب لا يتطلب التدرج فصل بالطرد المركزي في أوقات طويلة أو استخدام جسم وافرة للفرز و، ولذلك يقدم أكثر دليل كفاءة والأمثل للباحثين العاملين في ميدان الأيضية الأنبوبي الكلوي. وهناك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول، بما في ذلك الهضم، وإعادة جمع، وكثافة الطلاء ومجمع الأمثل للمقايسة الجريان خارج الخلية.
اختيار النوع الصحيح من كولاجيناز وتركيز الأمثل هو مفتاح الهضم الناجحة، وتفكك خلايا أنبوبية من أنسجة الكلي. بالمقارنة مع أنواع أخرى من collagenases، كولاجيناز نوع 2 يحتوي على مستويات أعلى نسبيا من نشاط البروتياز، قادرة على الناي بهياكل الكلوي المدمجة. لتقليل احتمالات التلوث نتيجة التروية المطول ووقت الهضم، كان perfused كولاجيناز نوع 2 0.013% في 30 مل/دقيقة. تمت إزالة الكبسولة الكلوي إلا بعد أن تحصد من الحيوان كلا الكليتين وتحويلها إلى غطاء ثقافة خلية معقمة. الكلي كانت مفروم إلى قطع صغيرة واستمر الحضانة مع 10 مل الهضم المخزن المؤقت لآخر 5 دقائق الهضم الكامل وإطلاق سراح القصوى من خلايا أنبوبية.
وعلى الرغم من بعد الهضم، يتم تمرير تعليق الأنسجة من خلال عامل تصفية 70 ميكرون لإزالة قطعة النسيج كبيرة جداً، ستكون هناك عسر الهضم من الأنابيب التي تمر من خلال المرشح والبقاء داخل تعليق خلية والحصول على مطلي على الطبق الثقافة. يستغرق وقتاً أطول من المعتاد لهذه الأنابيب للإفراج عن خلايا أنبوبية ونعلق بثبات إلى الطبق الثقافة. ولذلك، من المهم بدلاً من جمع تعليق خلية والطرد المركزي لبيليه فاتحة الأنابيب وخلايا في اليوم الثاني بعد طلاء الخلية. هذه الخطوة الطرد المركزي ذات سرعة منخفضة كذلك إزالة أنواع الخلايا الأخرى التي أخف من خلايا أنبوبية ويسمح لخلايا أنبوبية والأنابيب فاتحة لتسوية.
تحديد كثافة الخلايا الصحيح هو الخطوة الأولى والأساسية مقايسة الجريان خارج الخلية ناجح. وأظهرت النتائج أن الخلايا 40,000 كل بئر في ميكروسكوبية XF96 مثالي لخلايا أنبوبية أولية في كل من الأحماض الدهنية ومقايسة تنفس المستندة إلى الجلوكوز (الشكل 3). في هذا البروتوكول، استخدمت خلايا أنبوبية معزولة للمقايسة الجريان خارج الخلية في الفقرات 1 و 2. الخلايا شبه مثقف لمرور 3، على الرغم من أنها تعبير عن علامات أنبوبي (الشكل 2) وأداء كريمة في فحوصات الاستقلاب (الشكل 3A)، وأظهرت مستويات التنفس القاعدية انخفض بالمقارنة مع مرور 2 (كما هو موضح بمقارنة التعرف الضوئي على الحروف في لوحات الموجود في أقصى اليسار من الشكل 3 ألف الرقم 3). قد لا يؤثر هذا الانخفاض على خلايا أنبوبية صحية كبيرة (على سبيل المثال، تلك المعزولة من الشباب البرية من نوع الفئران). بيد لدراسات على خلايا معزولة من كد الماوس النماذج التي لديها بالفعل تنفس المتقدرية تقلص، الممرات ارتفاع الخلايا قد يسبب انخفاض زيادة في التنفس القاعدية التي ستؤثر على نتائج الفحص الجريان خارج الخلية. في الدراسات التي أجريت هنا، الخلايا من مرور 1 والممر 2 أظهر ارتفاع مستويات التنفس القاعدية. ولذلك، في أعقاب هذا البروتوكول، نوصي باستخدام هذه الممرات اثنين في وقت مبكر للدراسات التنفس المتقدرية مع الخلايا المعزولة من الحيوانات السليمة والمريضة على حد سواء. خلايا من مرور 2 ينبغي أن لا تزال تؤخذ في الاعتبار إذا كانت الثقافة الفرعية مرور 1 لا تسفر عن خلايا كافية للمقايسة التمويه. بالإضافة إلى دراسات الاستقلاب، تبين ابحاثنا السابقة أن تيكس الأولية في مرور 3 يمكن أن تكون مفيدة للغاية للعلاجات مع المركبات التي يتبعها البروتين ودراسات الحمض النووي الريبي (البيانات لا تظهر). ومع ذلك، فإننا نقترح أن المحققين باستخدام هذا البروتوكول لعزل خلايا أنبوبية يجب أن تختار بعناية مرور الأمثل للتطبيقات البحثية المختلفة.
يستند مبدأ عمل تحليل الجريان خارج الخلية التفاعلات بين مركبات حقن ومجمعات سلسلة التنفس وأثر أونكوبلير. أوليجوميسين هو المانع الخامس المعقدة (ATP synthase) ويستخدم للتمييز بين استهلاك الأكسجين ترتبط ATP واستهلاك الأوكسجين المطلوب للتغلب على تسرب بروتون العادية عبر غشاء داخلي المتقدرية32. فككب uncouples استهلاك الأوكسجين من إنتاج ATP بتعطيل غشاء الميتوكوندريا المحتملة. وهكذا، ويوفر مقياسا لقدرة التنفس القصوى كما أنها تلتف القدرة المحدودة ل efflux أيون بروتون واسطة ATP synthase بالسماح نقل بروتون من خلال الغشاء. أنتيميسين-أ، مثبط الثالث معقدة، ووالروتينون، ومجمع أنا مانع، تستخدم في تركيبة لإيقاف التنفس المتقدرية كامل يسمح لتفريق بين mitochondrial مقابل استهلاك الأكسجين غير المتقدرية في الخلايا. ينبغي دائماً أن تكون تيتراتيد هذه المركبات لنوع خلية محددة قبل الفحص الجريان خارج الخلية لتحديد التركيزات المثلى التي تسفر عن المنحنيات التعرف الضوئي على الحروف الأمثل. هنا، نحن نوصي ميكرومتر 1 أوليجوميسين و 1 ميكرومتر من فككب 2 ميكرومتر من والروتينون/أنتيميسين A للمقايسة الجريان خارج الخلية في تيكس الأولية.
وفي الختام، يوفر هذا البروتوكول بطريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل الكلوية الأولية الدانية والبعيدة أنبوبي الخلايا الظهارية التي يمكن استخدامها لتقييم الاستقلاب المتقدرية السابقين فيفو. بينما هذا البروتوكول يمكن أن تكون مفيدة في مجموعة واسعة من دراسات البيولوجيا الجزيئية استكشاف الوظيفة البيولوجية للخلايا الظهارية الأنبوبي الكلوي، نعترف بقصوره عند تطبيقه على الدراسات التي تحتاج إلى الأنابيب الدانية أو البعيدة نقية. على سبيل المثال، تتطلب دراسات بشأن متلازمة لوي، انتقائية خلل أنبوبي الدانية33، أو دراسات بشأن القاصي الحماض الأنبوبي الكلوي، خلل أنبوبي القاصي34، بروتوكول أكثر تطورا لعزل الخلية و تنقية. ومع ذلك، لمعظم الدراسات التي تقارن بين الأنابيب مقابل جلوميرولي، ودراسات الشاشة المنظمين التنفس المتقدرية المحتملة في خلايا أنبوبية بصورة عامة، ينص البروتوكول نهجاً عمليا إنتاجية عالية. ولذلك، قد يكون هذا البروتوكول تطبيقات واسعة النطاق لدراسة خلل mitochondrial المرتبطة باضطرابات الكلي لأغراض التحقق من اكتشاف أو الهدف المخدرات.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها المنح التالية إلى لينا ألف شحادة: المعهد الوطني للصحة (R56HL132209 و 1R01HL140468) ومعهد بحوث القلب في ميامي.
Materials
| Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
| Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
| 2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
| Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | |
| Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
| DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
| Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
| TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
| MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
| Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |
References
- Bielesz, B., et al. Epithelial notch signaling regulates interstitial fibrosis development in the kidneys of mice and humans. Journal of Clinical Investigation. 120 (11), 4040-4054 (2010).
- Fabian, S. L., et al. Hedgehog-Gli pathway activation during kidney fibrosis. American Journal of Pathology. 180 (4), 1441-1453 (2012).
- Forbes, J. M. Mitochondria-power players in kidney function. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (7), 441-442 (2016).
- Suzuki, T., Furusato, M., Takasaki, S., Ishikawa, E. Giant mitochondria in the epithelial cells of the proximal convoluted tubules of diseased human kidneys. Laboratory Investigation. 33 (6), 578-590 (1975).
- Yuan, Y., et al. Mitochondrial dysfunction accounts for aldosterone-induced epithelial-to-mesenchymal transition of renal proximal tubular epithelial cells. Free Radical Biology & Medicine. 53 (1), 30-43 (2012).
- Kang, H. M., et al. Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development. Nature Medicine. 21 (1), 37-46 (2015).
- Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney International. 61 (2), 387-395 (2002).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Kamiyama, M., Garner, M. K., Farragut, K. M., Kobori, H. The establishment of a primary culture system of proximal tubule segments using specific markers from normal mouse kidneys. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 5098-5111 (2012).
- Terryn, S., et al. A primary culture of mouse proximal tubular cells, established on collagen-coated membranes. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), F476-F485 (2007).
- Tang, M. J., Suresh, K. R., Tannen, R. L. Carbohydrate metabolism by primary cultures of rabbit proximal tubules. American Journal of Physiology. 256, C532-C539 (1989).
- Gesek, F. A., Wolff, D. W., Strandhoy, J. W. Improved separation method for rat proximal and distal renal tubules. American Journal of Physiology. 253, F358-F365 (1987).
- Vinay, P., Gougoux, A., Lemieux, G. Isolation of a pure suspension of rat proximal tubules. American Journal of Physiology. 241 (4), F403-F411 (1981).
- Taub, M., Chuman, L., Saier, M. H., Sato, G. Growth of Madin-Darby canine kidney epithelial cell (MDCK) line in hormone-supplemented, serum-free medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3338-3342 (1979).
- Chung, S. D., Alavi, N., Livingston, D., Hiller, S., Taub, M. Characterization of primary rabbit kidney cultures that express proximal tubule functions in a hormonally defined medium. Journal of Cell Biology. 95 (1), 118-126 (1982).
- Rubera, I., et al. Chloride currents in primary cultures of rabbit proximal and distal convoluted tubules. American Journal of Physiology. 275, F651-F663 (1998).
- Inoue, C. N., et al. Use of cultured tubular cells isolated from human urine for investigation of renal transporter. Clinical Nephrology. 53 (2), 90-98 (2000).
- Van der Hauwaert, C., et al. Isolation and characterization of a primary proximal tubular epithelial cell model from human kidney by CD10/CD13 double labeling. PLoS One. 8 (6), e66750 (2013).
- Helbert, M. J., Dauwe, S. E., Van der Biest, I., Nouwen, E. J., De Broe, M. E. Immunodissection of the human proximal nephron: flow sorting of S1S2S3, S1S2 and S3 proximal tubular cells. Kidney International. 52 (2), 414-428 (1997).
- Wen Ding, K. Y., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
- Quadri, J. A., et al. Fluoride-associated ultrastructural changes and apoptosis in human renal tubule: a pilot study. Human & Experimental Toxicology. , (2018).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).
- Condorelli, L., et al. Effect of fluid shear stress on tubular kidney epithelial cell structure. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. 25 (10), 50-52 (2009).
- Aschauer, L., et al. Delineation of the key aspects in the regulation of epithelial monolayer formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (13), 2535-2550 (2013).
- George, S. K., et al. Potential use of autologous renal cells from diseased kidneys for the treatment of renal failure. PLoS One. 11 (10), e0164997 (2016).
- Elberg, G., et al. MKL1 mediates TGF-beta1-induced alpha-smooth muscle actin expression in human renal epithelial cells. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 294 (5), F1116-F1128 (2008).
- Elberg, G., Guruswamy, S., Logan, C. J., Chen, L., Turman, M. A. Plasticity of epithelial cells derived from human normal and ADPKD kidneys in primary cultures. Cell and Tissue Research. 331 (2), 495-508 (2008).
- Cai, Q., et al. Toxicity of acetaminophen, salicylic acid, and caffeine for first-passage rat renal inner medullary collecting duct cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 306 (1), 35-42 (2003).
- Zhao, Y., et al. Isolation and epithelial co-culture of mouse renal peritubular endothelial cells. BMC Cell Biology. 15, 40 (2014).
- Barros, M. H., Hauck, F., Dreyer, J. H., Kempkes, B., Niedobitek, G. Macrophage polarisation: An immunohistochemical approach for identifying M1 and M2 macrophages. PLoS One. 8 (11), e80908 (2013).
- Kim, M., et al. Progression of Alport kidney disease in Col4a3 knock out mice is independent of sex or macrophage depletion by clodronate treatment. PLoS One. 10 (11), e0141231 (2015).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthethase system. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
- Bockenhauer, D., et al. Renal phenotype in Lowe Syndrome: a selective proximal tubular dysfunction. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 3 (5), 1430-1436 (2008).
- Ranawaka, R., Dayasiri, K., Gamage, M. A child with distal (type 1) renal tubular acidosis presenting with progressive gross motor developmental regression and acute paralysis. BMC Research Notes. 10 (1), 618 (2017).
