Denne protokollen gir en kostnadseffektiv tilnærming for å isolere og karakterisere musen primære nyre rørformede celler som kan senere sub kultivert for å vurdere nyre biologiske funksjoner ex vivo, inkludert mitokondrie bioenergi.
Mitokondrielt dysfunksjon i nyre rørformede epitelceller (TECs) kan føre til nedsatt fibrosis, en viktig årsak til kronisk nyresykdom (Parallelt). Derfor kan vurdere mitokondrie funksjon i primære TECs gi verdifull innsikt i bioenergetisk status av celler, gir innsikt i Patofysiologien ved Parallelt. Det finnes en rekke komplekse protokoller tilgjengelig for isolasjon og rensing av proksimale tubules i ulike arter, mangler feltet en kostnadseffektiv metode optimalisert for rørformede cellen aisolering uten behov for rensing. Her gir vi en isolasjon protokoll som tillater studier med fokus på både primær mus proksimale og distale nyre TECs. Kostnadseffektiv reagenser og minimal animal prosedyrer i denne protokollen, isolerte cellene opprettholde høyt energinivå etter isolasjon og kan være sub kulturperler opptil fire passasjer, muliggjør kontinuerlig studier. Videre vurderer bruker en høy gjennomstrømning ekstracellulære flux analysator, vi mitokondrie åndedrett direkte i de isolerte TECs i en 96-brønns plate som vi gir anbefalinger for optimalisering av cellen tetthet og sammensatte konsentrasjon. Disse observasjonene foreslår at denne protokollen kan bli brukt for nyre rørformede ex vivo studier ved konsekvent, godt standardisert produksjon av nyre TECs. Denne protokollen må bredere framtidige applikasjoner å studere mitokondrie dysfunksjon knyttet renal lidelser for medisiner eller narkotika karakterisering formål.
Nyre rørformede tarmepitelet (TEC) funksjonen er sterkt assosiert med den generelle helsetilstanden av nyret. Patologisk signalering i nyrene fører til dedifferentiation av TECs, som spiller en viktig rolle i nyre fibrose og kroniske nyre sykdom (Parallelt)1,2. Som en svært energiske orgel er nyre andre bare til hjertet i oksygenforbruk, primært gjennom mitokondrie oxidative fosforylering3. Elektronmikroskop studier har vist en positiv korrelasjon for mitokondrie morfologiske patologisk hendelser i nyre tubuli4. Mitokondrielt dysfunksjon i TECs fører til nyre fibrose gjennom epithelial til mesenchymal overgang5 og defekt fettsyrer oksidasjon6. Fibrose er en progressiv nyre patologi som fører til Parallelt. Forstå statusen energisk for nyre TECs er derfor en nødvendighet å avdekke i Patofysiologien ved Parallelt.
Det er > 20 celletyper i voksen nyre7. For å studere funksjonen i TECs, er en primær kultur for nyre epitelceller nødvendig som en plattform for molekylærbiologi programmer som kjemiske behandlinger og genetisk manipulasjon. Viktigere, kan genetisk manipulasjon gjøres i vivo i mus via transgenesis eller bruker AAV gen levering teknikker8 slik at isolert primære cellene ville allerede være genetisk manipulerte. Isolasjon av primære nyre rørformede celler fra mus9,10, rotter11,12,13, hjørnetann14, kanin15,16og mennesker17 ,18 har blitt rapportert med rensing skritt å gi ren proksimale rørformede celler. I disse publisert tidligere protokoller som fokuserer på isolasjon av proksimale rørformede celler ble gradient sentrifugering og sortering eksperimenter utført for rensing formål19. Mens disse protokollene er verdifulle for å studere proksimale tubuli, er de ikke nok når både proksimale og distale tubuli trengs å bli undersøkt. For eksempel har vår studie for Alport syndromet avdekket at både proksimale og distale nyre tubuli spille viktige roller i sykdom progresjon20, og derfor begge typer på nyre tubuli bør utredes kultur. En fersk studie på nyre fluor toksisitet viste også at patologiske forandringer fant sted i begge proksimale og distale tubuli21. Derfor er denne isolasjon protokollen utformet og optimalisert for både proksimale og distale rørformede celler fra musen nyrer med en minimal reagenser og enkle prosedyrer. Etterforskerne kan eventuelt fortsatt følger protokollen til trinn 3.1 og legge rensing trinn9 fra dette tidspunktet for isolering av ren proksimale rørformede celler.
Isolert cellene presenterer høye energisk nivåer og opprettholde nyre epithelial egenskaper etter sub-kulturer til 4 passasjer. Bruker en høy gjennomstrømning ekstracellulære flux analysator, vurderer vi mitokondrie åndedrett direkte i de isolerte TECs i en 96-brønns plate, som fører til ytterligere innsikt i cellen tetthet optimalisering. Disse observasjonene foreslår at denne protokollen kan brukes til nedsatt tubulær ex vivo studier ved konsekvent, godt standardisert produksjon av nyre TECs. En ekstra betydningen av denne protokollen er mulig bruk som en høy gjennomstrømning verktøy for ex vivo karakterisering av mitokondrie bioenergi i nyre proksimale og distale rørformede celler. Derfor kan det tjene som en plattform for medisiner eller narkotika karakterisering formål renal lidelser.
Vi optimalisert en protokoll som gir mulighet for effektiv isolasjon av mus nyre rørformede epitelceller (TECs) og viste at cellene kan sub kultivert for en ekstracellulære flux analyse for å vurdere mitokondrie åndedrett i nærvær av fettsyrer- og/eller glukose-baserte underlag. Denne protokollen er utformet for studier med fokus på både proksimale og distale rørformede celler og fungerer som et rammeverk med å bygge mer komplekse eksperimenter for forståelsen av TEC patologi-assosiert nyre sykdommer. I forhold til tidligere publiserte protokoller9,10,19, denne metoden krever ikke gradering separasjoner lenge sentrifugering ganger eller en rikelig antistoff behandling for sortering og, derfor gir en mer effektiv og optimalisert guide for forskere arbeider i nyre rørformede metabolske feltet. Det er flere viktige trinn i denne protokollen, inkludert fordøyelsen, re samling, og plating tetthet og sammensatte optimalisering for ekstracellulære flux analysen.
Velge riktig collagenase og optimal konsentrasjon er nøkkelen til en vellykket fordøyelsen og av rørformede cellene fra nyre vev. Sammenlignet med andre typer collagenases, inneholder type 2 collagenase relativt høyere nivåer av protease aktivitet, kan dissociating kompakt nyre strukturer. For å minimere sjansene for forurensning som følge av en langvarig perfusjon og fordøyelsen, var 0.013% type 2 collagenase parfyme på 30 mL/min. Nyre kapselen var bare fjernet etter begge nyrer ble høstet fra dyret og overført til sterilisert celle kultur hette. Nyrene ble hakket i små biter og fortsatte sine inkubering med 10 mL av en fordøyelsen buffer for en annen 5 min for en komplett fordøyelsen og maksimal utgivelsen av rørformede cellene.
Selv etter fordøyelsen, vev suspensjon sendes gjennom en 70-µm filter fjerne stor vev stykker, vil det fortsatt være ufordøyd tubuli som passerer gjennom filteret og bo i cellen suspensjon og få belagt på kultur parabolen. Det tar lengre tid enn normalt for disse tubuli å løslate rørformede celler og legge fast kultur parabolen. Derfor er det heller viktig å samle celle suspensjon og sentrifuge det pellets de ledige tubuli og den andre dagen etter at cellen belegget. Dette lav hastighet sentrifugering trinn videre fjerner andre celletyper som er lysere enn rørformede celler og ledige tubuli og rørformede celler å avgjøre.
Identifikasjon av riktig celle tetthet er det første og viktigste trinnet for en vellykket ekstracellulære flux analysen. Resultatene viste at 40.000 celler per brønn på en XF96 microplate er ideell for primære rørformede celler i både en fettsyrer og en glukose-baserte åndedrett analysen (Figur 3 c). I denne protokollen, ble isolerte rørformede celler brukt for ekstracellulære flux analysen på passasjer 1 og 2. Cellene sub kultivert for å passasje 3, selv om de opprettholdt et uttrykk for rørformede markører (figur 2) og en anstendig ytelse i bioenergi analyser (figur 3A), og viste redusert basale åndedrett nivåer sammenlignet passage 2 (vises ved å sammenligne OCR i høyre paneler av figur 3A til Figur 3 c). Denne nedgangen kan ikke påvirke vesentlig friske rørformede celler (for eksempel de isolert fra unge vill-type mus). Men for studier på celler isolert fra CKD musen modeller som har et redusert mitokondrie åndedrett, kan høyere passasjer cellene forårsake en ytterligere reduksjon i basal åndedrett som vil påvirke resultatene av ekstracellulære flux analysen. I studier gjennomført her cellene fra både passering 1 og passasje 2 viste høy basale åndedrett nivåer. Etter denne protokollen anbefaler vi derfor bruker disse to tidlig passasjer for mitokondrie åndedrett studier med celler isolert fra både friske og syke dyr. Celler fra passasje 2 bør likevel tas hensyn hvis passering 1 sub kultur ikke gir nok celler for flux analysen. I tillegg til bioenergi studier viser våre tidligere forskning at primære TECs på passering 3 kan være svært nyttig for behandlinger med forbindelser fulgt av protein og RNA studier (data ikke vist). Som blir sagt, foreslår vi at etterforskerne bruke denne protokollen til å isolere rørformede celler bør nøye velge optimal passasjen til forskjellige forskningsformål.
Det arbeider rettprinsippet ekstracellulære flux analysen er basert på samspillet mellom de injiserte forbindelsene og åndedrett kjeden komplekser og effekten av uncoupler. Oligomycin er en inhibitor av komplekse V (ATP syntase) og brukes til å skille ATP-tilknyttet oksygenforbruk og oksygenforbruk som kreves for å overvinne vanlige proton lekkasjen over en mitokondrie indre membran32. FCCP uncouples oksygenforbruk fra ATP produksjonen ved å forstyrre den mitokondrie membranen potensial. Dermed gir en måleenhet for maksimal åndedrett kapasiteten som det omgår den begrensede kapasiteten på en proton ion middelklasseinnbyggere av ATP syntase ved at proton transport gjennom membran. Antimycin-A, en kompleks III inhibitor, og rotenon, et kompleks jeg blokkering, brukes i kombinasjon for å stenge ned hele mitokondrie åndedrett tillater mellom den mitokondrie vs ikke-Mitokondrielt oksygenforbruk i cellene. Disse forbindelsene bør alltid være titreres for en bestemt celle type før ekstracellulære flux analysen til å bestemme de optimale konsentrasjonene som gir optimal OCR kurvene. Her anbefaler vi 1 µM oligomycin, 1 µM av FCCP og 2 µM av rotenon/antimycin A for ekstracellulære flux analysen på primære TECs.
Avslutningsvis gir denne protokollen en enkel og kostnadseffektiv måte å isolere nyre primære proksimale og distale rørformede epitelceller som kan brukes for å vurdere mitokondrie bioenergi ex vivo. Mens denne protokollen kan være nyttig i en rekke molekylærbiologi studier utforske biologisk funksjon av nyre rørformede epitelceller, erkjenner vi begrensninger når det gjelder studier trenger ren proksimale eller distale tubuli. For eksempel studier på Lowe syndromet, en selektiv proksimale rørformede dysfunksjon33eller studier på distale nedsatt tubulær acidose, en distale rørformede dysfunksjon34, ville kreve en mer sofistikert protokoll for cellen aisolering og rensing. Men gir for fleste av studiene som sammenligner tubuli g. glomeruli, og studier til skjermen potensielle mitokondrie åndedrett regulatorer i rørformede celler generelt, protokollen en mulig høy gjennomstrømning tilnærming. Denne protokollen kan derfor har bred programmer å studere mitokondrie dysfunksjon knyttet renal lidelser for drug discovery eller mål kontrollhensyn.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd til Lina A. Shehadeh: National Institute of Health (R56HL132209 og 1R01HL140468) og Miami hjertet Research Institute.
Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |