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Neurosciences

Singola cella multisala trascrizione inversa Polymerase Chain Reaction dopo Patch-clamp

Published: June 20, 2018
doi:
10.3791/57627
, , ,
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine – Institut de Biologie Paris Seine (NPS – IBPS),Sorbonne Université

Summary

Questo protocollo descrive le fasi critiche e le precauzioni necessarie per eseguire la singola cella multisala trascrizione d’inversione della polimerasi reazione a catena dopo patch clamp. Questa tecnica è un metodo semplice ed efficace per analizzare il profilo di espressione di un insieme predeterminato di geni da una singola cellula caratterizzata da registrazioni di patch-clamp.

Abstract

La corteccia cerebrale è composto da numerosi tipi di cellule che esibiscono le varie caratteristiche morfologiche, fisiologiche e molecolari. Questa diversità ostacola la facile identificazione e caratterizzazione di questi tipi di cellule, prerequisiti per studiare le loro funzioni specifiche. Questo articolo viene descritto il protocollo multisala singola cella trascrizione d’inversione della polimerasi reazione a catena (RT-PCR), che consente, dopo la registrazione a fette, patch-clamp per rilevare simultaneamente l’espressione di decine di geni in una singola cella. Questo semplice metodo può essere implementato con caratterizzazione morfologica ed è ampiamente applicabile per determinare i tratti fenotipici di vari tipi di cellule e il loro particolare ambiente cellulare, come ad esempio in prossimità di vasi sanguigni. Il principio di questo protocollo è per registrare una cella con la tecnica del patch-clamp, per raccogliere e invertire trascrivere il suo contenuto citoplasmatico, e per rilevare qualitativamente l’espressione di un insieme predefinito di geni di multiplex PCR. Richiede un’attenta progettazione di iniettori di PCR e intracellulare patch clamp soluzione compatibile con RT-PCR. Per garantire una trascrizione selettiva e affidabile rilevamento, questa tecnica richiede anche controlli appropriati dal citoplasma raccolto ai passaggi di amplificazione. Sebbene precauzioni discussi qui devono essere strettamente seguite, praticamente qualsiasi laboratorio elettrofisiologico possibile utilizzare la cella singola multisala tecnica RT-PCR.

Introduction

La corteccia cerebrale comprende numerosi tipi cellulari coinvolti in vari processi fisiologici. Loro identificazione e caratterizzazione, un prerequisito per la comprensione delle loro specifiche funzioni, può essere molto difficile data la grande diversità morfologiche, fisiologiche e molecolari che caratterizza di tipi delle cellule corticali1 ,2,3,4.

Cella singola multiplex RT-PCR si basa sulla combinazione di patch-clamp e tecniche di RT-PCR. E ‘ possibile sondare contemporaneamente l’espressione di predefiniti oltre 30 geni in cellule electrophysiologically identificato5. L’inclusione di un tracciante neuronale in ulteriormente la pipetta di registrazione permette la caratterizzazione morfologica delle cellule registrate dopo la rivelazione istochimica6,7,8,9, 10. è una tecnica molto utile per la classificazione dei tipi neuronali basato sull’analisi multivariata di loro tratti fenotipici5,9,10,11,12 ,13,14. Singola cella RT-PCR multiplex è adatto anche per la caratterizzazione di cellule non neuronali come astrociti15,16,17e può essere applicato praticamente a ogni cervello struttura18, 19,20,21,22,23 e cella tipo, supponendo che essi possono essere registrati nella configurazione di cellule intere.

Questa tecnica è molto conveniente per l’identificazione di fonti cellulari e/o obiettivi di trasmissione sistemi7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, soprattutto quando gli anticorpi specifici sono carenti. Esso si basa su registrazioni di patch-clamp da cellule visivamente identificati29e così permette anche l’ottimizzazione delle cellule in un ambiente cellulare specifico8,15,16. Inoltre poiché la citoarchitettura del tessuto cerebrale è conservato nelle fette del cervello, questo approccio consente inoltre studio dei rapporti anatomici delle cellule caratterizzate con elementi neuronali e non neuronali7,8 , 18.

Poiché questa tecnica è limitata dalla quantità di citoplasma raccolto e dall’efficienza della RT, il rilevamento del mRNA espresso al numero basso di copia può essere difficile. Anche se altri approcci basati sulla tecnologia di RNaseq permettono di analizzare l’intero trascrittoma di singole cellule3,4,30,31, hanno bisogno di alto-rendimento costoso sequencer non necessariamente disponibile per ogni laboratorio. Poiché la tecnica di RT-PCR multiplex singola cella utilizza PCR end-point, richiede solo thermocyclers ampiamente disponibili. Esso può essere facilmente sviluppata nei laboratori attrezzati con allestimenti elettrofisiologici e non richiede costose attrezzature. E ‘ in grado di fornire, entro un giorno, un’analisi qualitativa dell’espressione di un insieme predefinito di geni. Così, questo approccio offre un facile accesso per la caratterizzazione molecolare delle singole cellule in modo rapido.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali utilizzando animali sono state eseguite in stretta conformità con norme francesi (codice rurale R214/87 R214/130) e conforme alle linee guida etiche di Comunità economica europea (86/609/CEE) e la carta nazionale francese sull’etica della sperimentazione animale. Tutti i protocolli sono stati approvati dal comitato etico di Charles Darwin e presentati al Ministero francese dell’educazione e della ricerca (approvazione 2015 061011367540). La struttura animale IBPS è accreditata dalle aut…

Representative Results

Una rappresentanza convalida di RT-PCR multiplex è illustrata nella Figura 3. Il protocollo è stato progettato per sondare contemporaneamente l’espressione di 12 geni diversi. Il vGluT1 del trasportatore vescicolare del glutammato è stato preso come un controllo positivo di neuroni glutamatergici42. Il GABA sintetizzare gli enzimi (GAD65 e GAD 67), Neuropeptide Y (NPY) e somatostatina (SOM) sono stati usati come indicatori di GABAer…

Discussion

Singola cella RT-PCR multiplex dopo patch-clamp può sondare contemporaneamente e in modo affidabile l’espressione di più di 30 geni in cellule electrophysiologically identificato5. L’analisi di espressione genica a livello di singola cellula richiede gli iniettori di PCR altamente efficienti. Uno dei passi più limitanti è la raccolta del contenuto della cella. Sua efficienza dipende dal diametro del puntale della pipetta patch, deve essere più grande possibile, mentre le dimensioni della cell…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il dottor Alexandre Mourot per i suoi commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 01 003; ANR-15-CE16-0010 e ANR-17-CE37-0010-03), BLG è supportato da fellowship dal Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Ringraziamo la struttura animale di IBPS (Parigi, Francia).

Materials

MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series – 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series – 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series – 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series – 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation
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Citer Cet Article
Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).
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