Dieses Protokoll beschreibt die kritische Schritte und Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, einzelne Zelle multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-Clamp durchzuführen. Diese Technik ist eine einfache und effektive Methode um das Expressionsprofil eines vorgegebenen Satzes Gene aus einer einzigen Zelle zeichnet sich durch Patch-Clamp-Aufnahmen zu analysieren.
Die Großhirnrinde besteht aus zahlreichen Zelltypen, die verschiedenen morphologische, physiologische und molekulare Eigenschaften ausstellen. Diese Vielfalt behindert einfache Identifizierung und Charakterisierung dieser Zelltypen, Voraussetzungen, um ihre spezifischen Funktionen zu studieren. Dieser Artikel beschreibt das Multiplex-Einzelzelle reversen Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) Protokoll, das, nach Patch-Clamp-Aufnahme in Scheiben schneiden, ermöglicht gleichzeitig die Expression von Zehntausenden Gene in einer einzelnen Zelle erkennen. Diese einfache Methode kann mit Morphologische Charakterisierung durchgeführt werden und gilt allgemein für die phänotypische Merkmale der verschiedenen Zelltypen und ihre bestimmten zellulären Umgebung, wie z. B. in der Nähe von Blutgefäßen zu bestimmen. Das Prinzip dieses Protokolls ist aufzeichnen eine Zelle mit der Patch-Clamp-Technik, zu ernten und umkehren transkribieren zytoplasmatischen inhaltlich und qualitativ zu erkennen der Ausdruck der einen vordefinierten Satz von Genen durch multiplex-PCR. Es erfordert eine sorgfältige Planung der PCR Zündkapseln und intrazellulären Patch-Clamp-Lösung kompatibel mit RT-PCR. Um eine selektive und zuverlässige Abschrift zu gewährleisten benötigt-Erkennung, diese Technik auch entsprechende Kontrollen von Zytoplasma Ernte zur Verstärkung Schritte. Obwohl hier beschriebenen Vorsichtsmaßnahmen strikt befolgt werden müssen, kann praktisch alle elektrophysiologischen Labor die Multiplex-einzelne Zelle RT-PCR-Technik verwenden.
Die Großhirnrinde besteht aus zahlreichen Zelltypen in verschiedenen physiologischen Prozessen beteiligt. Ihre Identifizierung und Charakterisierung, eine Voraussetzung für das Verständnis ihrer spezifischen Funktionen können sehr anspruchsvoll sein angesichts der großen morphologische, physiologische und molekulare Vielfalt, die kortikale Zelle Arten1 charakterisiert ,2,3,4.
Einzellige Multiplex-RT-PCR basiert auf der Kombination von Patch-Clamp und RT-PCR-Techniken. Es kann gleichzeitig die Expression von mehr als 30 vordefinierte Genen Elektrophysiologisch identifizierten Zellen5Sonde. Die Einbeziehung eines neuronalen Tracers in der Aufnahme-Pipette weiter ermöglicht die Morphologische Charakterisierung der aufgezeichneten Zellen nach histochemische Offenbarung6,7,8,9, 10. es ist eine sehr nützliche Technik für die Klassifizierung von neuronalen Arten anhand der multivariaten Analyse ihrer phänotypischen Merkmale5,9,10,11,12 ,13,14. Einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR eignet sich auch zur Charakterisierung von nicht-neuronalen Zellen wie Astrozyten15,16,17und kann praktisch auf jedem Gehirn Struktur18angewendet werden, 19,20,21,22,23 und Zelle Art, vorausgesetzt, sie können in ganz-Zell Konfiguration aufgenommen werden.
Diese Technik ist sehr praktisch für die Identifizierung von zellulären Quellen bzw. Ziele der Übertragung Systeme7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, vor allem, wenn spezifische Antikörper fehlen. Es stützt sich auf Patch-Clamp-Aufnahmen von visuell identifizierte Zellen29und ermöglicht somit auch die Ausrichtung der Zellen in einem bestimmten zellulären Umgebung8,15,16. Außerdem da die Cytoarchitecture von Hirngewebe in Gehirnscheiben bewahrt wird, ermöglicht dieser Ansatz auch Studie über die anatomischen Verhältnisse der gekennzeichneten Zellen mit neuronalen und nicht-neuronale Elements7,8 , 18.
Da diese Technik durch die Menge des geernteten Zytoplasma und die Effizienz des RT begrenzt ist, kann der Nachweis von mRNA ausgedrückt bei geringen Kopienzahl schwierig sein. Obwohl andere Ansätze, basierend auf RNaseq-Technologie ermöglichen, um das ganze Transkriptom Einzelzellen3,4,30,31, zu analysieren, benötigen sie Hochdurchsatz-teure Sequenzer nicht unbedingt Jedes Labor zur Verfügung. Da die einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR Technik Endpunkt PCR verwendet, erfordert es nur allgemein verfügbar Thermocycler. Es kann leicht in Laboratorien ausgestattet mit elektrophysiologischen Setups entwickelt werden und erfordert keine teure Ausrüstung. Es kann innerhalb eines Tages eine Qualitative Analyse des Ausdrucks einen vordefinierten Satz von Genen bereitstellen. So bietet dieser Ansatz eine gute Anbindung an die molekulare Charakterisierung einzelner Zellen in einer schnellen Weise.
Einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR nach Patch-Clamp zuverlässig und gleichzeitig die Expression von mehr als 30 Genen Elektrophysiologisch identifizierten Zellen5Sonde kann. Analyse der Genexpression auf der Ebene der einzelnen Zelle erfordert hocheffiziente PCR-Primer. Eine der am meisten einschränkenden Maßnahmen ist Sammlung des Zellinhalts. Seine Wirksamkeit hängt vom Durchmesser des Patch-PIPETTENSPITZE, die so groß wie möglich sein muss, während die passende Größe der Zellen. Pipetten …
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Alexandre Mourot für seine Bemerkungen über das Manuskript. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der Agence Nationale De La Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 und ANR-17-CE37-0010-03), BLG wird von der Fondation Pour la Recherche Sur Alzheimer-Stipendium unterstützt. Wir danken der Tierstation IBPS (Paris, Frankreich).
MACAW v.2.0.5 | NCBI | Multiple alignement for primer design | |
Dithiothreitol | VWR | 443852A | RT |
Random primers | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
dNTPs | GE Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | RT and PCR |
RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2511 | RT |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | RT |
Taq DNA Polymerase | Qiagen | 201205 | PCR |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich (Merck) | M5904-5ML | PCR |
PCR primers | Sigma-Aldrich (Merck) | PCR / desalted and diluted at 200 µM | |
Tubes, 0.5 mL, flat cap | ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT and PCR |
BT10 Series – 10 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT10 | RT and PCR |
BT20 Series – 20 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT20 | RT and PCR |
BT200 Series – 200 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT200 | RT and PCR |
BT1000 Series – 1000 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT1000.96 | RT and PCR |
DNA Thermal Cylcer | Perkin Elmer Cetus | PCR | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich (Merck) | E1510-10ML | Agarose gel electrophoresis |
Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich (Merck) | T4415-1L | Agarose gel electrophoresis |
UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | Agarose gel electrophoresis |
ΦX174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | Agarose gel electrophoresis |
EDA 290 | Kodak | Agarose gel electrophoresis | |
Electrophoresis Power supply EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Agarose gel electrophoresis | |
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 | Sigma-Aldrich (Merck) | Agarose gel electrophoresis | |
Smooth paper with satin appearance | Fisherbrand | 1748B | Patch clamp internal solution |
Potassium Hydroxyde | Sigma-Aldrich (Merck) | 60377 | Patch clamp internal solution |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | E3889 | Patch clamp internal solution |
HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | Patch clamp internal solution |
Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich (Merck) | G4500 | Patch clamp internal solution |
Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | M1028 | Patch clamp internal solution |
5500 Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Patch clamp internal solution | |
Biocytin | Sigma-Aldrich (Merck) | B4261 | Patch clamp internal solution |
Sucrose | Sigma-Aldrich (Merck) | S5016 | Slice preparation |
D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | 49159 | Slice preparation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | S6191 | Slice preparation |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 60128 | Slice preparation |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich (Merck) | 31437-M | Slice preparation |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S5011 | Slice preparation |
Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 63069 | Slice preparation |
Calcium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | Slice preparation |
Kynurenic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | K3375 | Slice preparation |
Isoflurane | Piramal Healthcare UK | Slice preparation | |
VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | Slice preparation |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich (Merck) | H1009 | Patch Clamp set-up cleaning |
Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW150F-4 | Patch Clamp |
PP-83 | Narishige | Patch Clamp | |
Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956003 | Patch Clamp |
BX51WI Upright microscope | Olympus | Patch Clamp | |
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA | Sony | Patch Clamp | |
Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | Patch Clamp | |
Digidata 1440 | Molecular Devices | Patch Clamp | |
pCLAMP 10 software suite | Molecular Devices | Patch Clamp | |
10 mL syringe | Terumo | SS-10ES | Expelling |
E Series with Straight Body (Holder) | Phymep | 64-0997 | Expelling |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S7907 | Histochemical revelation |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S8282 | Histochemical revelation |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich (Merck) | P6148 | Histochemical revelation |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | X100 | Histochemical revelation |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich (Merck) | G7041 | Histochemical revelation |
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | S11223 | Histochemical revelation |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | Histochemical revelation |