Summary

Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp

Published: June 20, 2018
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt die kritische Schritte und Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, einzelne Zelle multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-Clamp durchzuführen. Diese Technik ist eine einfache und effektive Methode um das Expressionsprofil eines vorgegebenen Satzes Gene aus einer einzigen Zelle zeichnet sich durch Patch-Clamp-Aufnahmen zu analysieren.

Abstract

Die Großhirnrinde besteht aus zahlreichen Zelltypen, die verschiedenen morphologische, physiologische und molekulare Eigenschaften ausstellen. Diese Vielfalt behindert einfache Identifizierung und Charakterisierung dieser Zelltypen, Voraussetzungen, um ihre spezifischen Funktionen zu studieren. Dieser Artikel beschreibt das Multiplex-Einzelzelle reversen Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) Protokoll, das, nach Patch-Clamp-Aufnahme in Scheiben schneiden, ermöglicht gleichzeitig die Expression von Zehntausenden Gene in einer einzelnen Zelle erkennen. Diese einfache Methode kann mit Morphologische Charakterisierung durchgeführt werden und gilt allgemein für die phänotypische Merkmale der verschiedenen Zelltypen und ihre bestimmten zellulären Umgebung, wie z. B. in der Nähe von Blutgefäßen zu bestimmen. Das Prinzip dieses Protokolls ist aufzeichnen eine Zelle mit der Patch-Clamp-Technik, zu ernten und umkehren transkribieren zytoplasmatischen inhaltlich und qualitativ zu erkennen der Ausdruck der einen vordefinierten Satz von Genen durch multiplex-PCR. Es erfordert eine sorgfältige Planung der PCR Zündkapseln und intrazellulären Patch-Clamp-Lösung kompatibel mit RT-PCR. Um eine selektive und zuverlässige Abschrift zu gewährleisten benötigt-Erkennung, diese Technik auch entsprechende Kontrollen von Zytoplasma Ernte zur Verstärkung Schritte. Obwohl hier beschriebenen Vorsichtsmaßnahmen strikt befolgt werden müssen, kann praktisch alle elektrophysiologischen Labor die Multiplex-einzelne Zelle RT-PCR-Technik verwenden.

Introduction

Die Großhirnrinde besteht aus zahlreichen Zelltypen in verschiedenen physiologischen Prozessen beteiligt. Ihre Identifizierung und Charakterisierung, eine Voraussetzung für das Verständnis ihrer spezifischen Funktionen können sehr anspruchsvoll sein angesichts der großen morphologische, physiologische und molekulare Vielfalt, die kortikale Zelle Arten1 charakterisiert ,2,3,4.

Einzellige Multiplex-RT-PCR basiert auf der Kombination von Patch-Clamp und RT-PCR-Techniken. Es kann gleichzeitig die Expression von mehr als 30 vordefinierte Genen Elektrophysiologisch identifizierten Zellen5Sonde. Die Einbeziehung eines neuronalen Tracers in der Aufnahme-Pipette weiter ermöglicht die Morphologische Charakterisierung der aufgezeichneten Zellen nach histochemische Offenbarung6,7,8,9, 10. es ist eine sehr nützliche Technik für die Klassifizierung von neuronalen Arten anhand der multivariaten Analyse ihrer phänotypischen Merkmale5,9,10,11,12 ,13,14. Einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR eignet sich auch zur Charakterisierung von nicht-neuronalen Zellen wie Astrozyten15,16,17und kann praktisch auf jedem Gehirn Struktur18angewendet werden, 19,20,21,22,23 und Zelle Art, vorausgesetzt, sie können in ganz-Zell Konfiguration aufgenommen werden.

Diese Technik ist sehr praktisch für die Identifizierung von zellulären Quellen bzw. Ziele der Übertragung Systeme7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, vor allem, wenn spezifische Antikörper fehlen. Es stützt sich auf Patch-Clamp-Aufnahmen von visuell identifizierte Zellen29und ermöglicht somit auch die Ausrichtung der Zellen in einem bestimmten zellulären Umgebung8,15,16. Außerdem da die Cytoarchitecture von Hirngewebe in Gehirnscheiben bewahrt wird, ermöglicht dieser Ansatz auch Studie über die anatomischen Verhältnisse der gekennzeichneten Zellen mit neuronalen und nicht-neuronale Elements7,8 , 18.

Da diese Technik durch die Menge des geernteten Zytoplasma und die Effizienz des RT begrenzt ist, kann der Nachweis von mRNA ausgedrückt bei geringen Kopienzahl schwierig sein. Obwohl andere Ansätze, basierend auf RNaseq-Technologie ermöglichen, um das ganze Transkriptom Einzelzellen3,4,30,31, zu analysieren, benötigen sie Hochdurchsatz-teure Sequenzer nicht unbedingt Jedes Labor zur Verfügung. Da die einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR Technik Endpunkt PCR verwendet, erfordert es nur allgemein verfügbar Thermocycler. Es kann leicht in Laboratorien ausgestattet mit elektrophysiologischen Setups entwickelt werden und erfordert keine teure Ausrüstung. Es kann innerhalb eines Tages eine Qualitative Analyse des Ausdrucks einen vordefinierten Satz von Genen bereitstellen. So bietet dieser Ansatz eine gute Anbindung an die molekulare Charakterisierung einzelner Zellen in einer schnellen Weise.

Protocol

Alle experimentelle Verfahren unter Verwendung von Tieren wurden durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit französischen Regelungen (Code Rural R214/87 bis R214/130) und entsprach den ethischen Richtlinien der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft (86/609/EWG) und der französischen Nationalcharta über die Ethik von Tierversuchen. Alle Protokolle wurden von Charles Darwin-Ethik-Kommission genehmigt und dem französischen Ministerium für Bildung und Forschung (Genehmigung 2015 061011367540) vorgelegt. Die IBPS Tie…

Representative Results

Eine repräsentative Validierung der Multiplex-RT-PCR ist in Abbildung 3dargestellt. Das Protokoll wurde entwickelt, um gleichzeitig die Expression von 12 verschiedenen Genen Sonde. Die vesikuläre Glutamat Transporter vGluT1 wurde als Positivkontrolle für glutamatergen Neuronen42übernommen. Die GABA-Synthese von Enzymen (GAD65 und GAD-67), NEUROPEPTID Y (NPY) und Somatostatin (SOM) dienten als Marker der Gabaergen Interneuronen<sup …

Discussion

Einzelne Zelle Multiplex-RT-PCR nach Patch-Clamp zuverlässig und gleichzeitig die Expression von mehr als 30 Genen Elektrophysiologisch identifizierten Zellen5Sonde kann. Analyse der Genexpression auf der Ebene der einzelnen Zelle erfordert hocheffiziente PCR-Primer. Eine der am meisten einschränkenden Maßnahmen ist Sammlung des Zellinhalts. Seine Wirksamkeit hängt vom Durchmesser des Patch-PIPETTENSPITZE, die so groß wie möglich sein muss, während die passende Größe der Zellen. Pipetten …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Alexandre Mourot für seine Bemerkungen über das Manuskript. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der Agence Nationale De La Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 und ANR-17-CE37-0010-03), BLG wird von der Fondation Pour la Recherche Sur Alzheimer-Stipendium unterstützt. Wir danken der Tierstation IBPS (Paris, Frankreich).

Materials

MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series – 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series – 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series – 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series – 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation

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Citer Cet Article
Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).

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