Summary

드 노 보 그렇 구나/TAZ에 의해 체세포 줄기 세포의 생성

Published: May 07, 2018
doi:

Summary

체세포 SCs의 가용성은 재생 의학에 대 한 중요 한 질병 모델링 및 사우스 캐롤라이나 속성에 대 한 통찰력을 얻을. 여기에 우리가 프로그램을 실험 전략 제시 에 체 외, 단일 transcriptional 공동 활성 야프의 과도 식으로 그들의 해당 확장 조직 관련 줄기/시 조 세포로 성인 세포 분화.

Abstract

여기 기본 분화 세포 및 녹음 방송 요인의 과도 식으로 같은 혈통의 줄기/시 조 세포 (SCs)로 그들 짖 차례 분리 프로토콜 선물이. 이 방법으로 마우스 유선의 luminal 차별화 (LD) 세포는 유 방 SCs. 얍 분자 속성과 기능 또한 회전 완전히 분화 췌 장 외 분 비 세포 췌 장로 덕트 같은 셀으로 변환 됩니다. 창시자입니다. 마찬가지로, 내 생, 자연 SCs를 유도 하는 YAP 줄기 모양의 셀 (“ySCs”) 확장할 수 있습니다 결국 organoid 문화 장기 생체 외에서, 소성 얍/TAZ의 추가 필요 없이 상속 자체 갱신 SC 같은 상태와 부여 하는 ySCs로.

여기에 제시 된 재활 절차를 생성 하 고 차별화 된 셀에서 시작 하는 다양 한 조직 소스의 조상 세포 생체 외에서 확장 가능성을 제공 합니다. Ex vivo 체세포의 간단한 확장 세포 및 개발 생물학 연구를 위한 일반적으로 종양 개시의 메커니즘을 이해 하 고, 더 많은 대 한 재생 의학에 대 한 의미를 갖는다.

Introduction

조직의 특정 체세포 줄기 세포 (SCs) 부상 후 조직 재생 및 복구에 대 한 중요 하다. 쉽게 분리 하 고 unlimitedly 확장 한다 확장 ex vivo 체세포 SCs 나타냅니다 중요 한 문제가 잠재적인 재생 치료, 뿐만 아니라 기본 연구 및 질병 모델링에 SC 응용 프로그램에 대 한 가능성. 하지만이 방향으로 진행, 다양 한 상피 장기 체 외의 SC 상태 캡처의 어려움에 의해 제한 되었습니다. 실제로, 여러 성인 조직에서 거주 SCs 수 있습니다 존재 하지 쉽게 사용할 수 없습니다 또는 그들의 번호와 재생 잠재력 노화 또는 질병 조건에 의해 침식 수 있습니다. 2016 년, 우리는 그 표현의 단일 transcriptional coactivator 보고 하 여이 간격을 채우기 위해 시작 얍 (예-관련 된 단백질) 또는 말기 차별화 된 세포로 그것의 밀접 하 게 관련된 단백질 TAZ (PDZ 모티브로 transcriptional 활성 제), 효율적으로 운영 및 분자로 그들의 해당 조직의 특정 SCs1분간 되지 않은 기능, 확장, 비 tumorigenic, 자가 세포 인구를 만듭니다. 펄스 지속 얍 또는 몇 일 동안 TAZ 활동 자체 갱신 체세포 SCs의 외관을 유도 하기에 충분. 이것은 소성 얍/TAZ1식 추가 없이 셀 세대를 통해 전달 될 수 있다로 연속 transgene 식에 의존은 더 이상 안정 된 상태 이다. 프로토콜 제시 여기 내용은 유선 및 췌 장,이 조직의 차별화 된 세포에서 시작의 드 노 보 상피 줄기/뿌리 세포를 생성 하는 데 사용 되는 절차. 이 절차는 현재 프로그래밍/transdifferentiation 경기장에서 블랙 박스를 채웁니다. 주요 활동 방향으로 지금까지 실제로 셀 전환 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 상태로, 이러한 배아의 변환 다음에 중심으로 고로 만능 SCs는 더 세포 분화. 그러나, Ipsc tumorigenic는 한 번 그들의 완전 하 고 효율적인 차별화2에 대 한 프로토콜 개발의 필요성을 제기 하는 성인 조직에 도입. 그러나,이 감 별 법 단계 가능한 경우에 온다 장기 확장성, 자기 조직 및 기관 repopulation 잠재력의 가격. 이들은 일반 생 조직 관련 SCs의만 및 현재 설명된 유도 하는 YAP SCs (ySCs)의 실제로 장기 재생을 위한 필수 특성입니다. 마찬가지로, 다양 한 녹음 방송 요인 또한 생성의 칵테일을 사용 하 여 다른 한 셀 형식의 직접 transdifferentiation 필수 증식 stemness 잠재적인3부족 세포 분화.

여기 설명 하는 절차 또한 활용 최근에 소개 된 organoid 기술, 여 생 SCs 확장 될 수 있다 및 비보 전4분화. 유도 하는 YAP SCs는 생 SCs 존재 하지 않는 실험, 생물 학적 또는 질병 조건 에서도 organoid 형성 SCs를 생성할 수 있습니다. 우리는, 다른 재활 절차와 차이에 셀 소성 얍에 의해이 수의 유형 생활 조직에서 발생 하는 사우스 캐롤라이나와 같은 상태에 복귀의 유일한 형태에 해당 수 있습니다 싶습니다. 사우스 캐롤라이나-같은 특성의 획득 조직 복구 또는 종양 활성화5와 연결 되었습니다. 비록 여러 성인 조직의 항상성 위해 불가결, 야프 TAZ는 재생, 종양 성장 및 체 외1,6,,78 체세포 SCs의 확장에 대 한 절대적으로 필수 9,10,,1112

Protocol

우리의 기관 지침을 준수 하 고 OPBA 및 건강의 교육부에 의해 승인 모든 동물 절차 수행 했다 1. 야프 유도 유 방 줄기 모양의 셀 (yMaSCs)의 생성 참고: 모든 미디어와 솔루션 구성 섹션 1 표 1에 지정 됩니다. 기본 유 방 세포 인구의 절연 셀 문화 후드 준비: 일회용 scalpels hyaluronidase 솔루션, 분리 매체, hemolytic 솔루션, 정렬 솔루션, 내가 코팅 솔루션, 캘리포니아2 + chelating 솔루션, 세척 매체 #1 세척 중간 #2, dispase 솔루션, 콜라겐 유 방 2D 문화 매체, 얼음 차가운 HBSS/추 전형적인 실험에 대 한 희생 10 여성 쥐 (CD-1 C57BL/6 스트레인의), 8-12 주 오래 된 자 궁 경부 전위에 의해. 절 개 전에 풍부한 70% 에탄올 솔루션으로 복 부를 소독. 복 부 피부 따라 Y 자 모양의 절 개를 하 고 신중 하 게 Dumont 집게로 살짝 당겨 복 막에서 동맥을 분리 하 여 유 방 동맥 해 부. 해 부 동맥 10 mL 얼음 비 세포 접착 접시에 놓고 차가운 HBSS/PS (각 요리에 대 일 분 비), 모든 피부 부분이 월 하지 않아야 함. 조직 문화 후드 신선한 HBSS/PS의 10 mL에 각 선을 한 번 세척 하 고는 빈 셀이 아닌 접착제 요리 (각 요리에 대 일 분 비)에 배치 합니다. 셀 것 이다 그들에 게 충실 하는 경향이 조직 문화 접시를 사용 하지 않는 재료의 상당한 손실을 일으키는 원인이 되. 1 m m3 파편의 균질 성 혼합 얻을 때까지 가늘게 scalpels와 유 방 땀 샘을 말하다. 막힘 방지를 적어도 5 x 세분화 조직 덩어리를 pipetting 50 mL 원뿔 튜브에 정지를 전송 25 mL 혈 청 학적인 피 펫과 분리 매체의 10 mL에 각 접시에서 다진된 조직을 복구 합니다.참고: 효율적인 소화 단계 1.1.5에서에서 조직의 적절 한 닦지 중요 하다. 연속 활기찬 동요와 37 ° C에서 1 시간에 품 어. 1 시간 후에 homogenate를 확인 하 고 수 풀은 여전히 존재 하는 경우 부 화 10 분 연장. 실 온에서 5 분에 대 한 400 x g에서 소화 조직을 아래로 회전 시키십시오 그리고 삭제는 상쾌한. 3 ml hemolytic 솔루션의 조직 펠 릿을 resuspend 하 고 얼음에 3 분을 품 어.참고: 혈 이므로 오히려 가혹한 처리, 엄격한 타이밍은이 단계에서 중요 한. 세척 매체 # 1의 10 mL로 세포를 세척 하 고 스핀 5 분에 대 한 400 x g에서 소화 조직 다운 삭제는 상쾌한. 세척 매체 # 2와 10cm 조직 문화 접시에 접시의 10 mL에 조직 펠 릿을 resuspend. 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간을 위한 요리를 품 어.참고:이 단계는 문화 접시에 고착 해야 하는 섬유 아 세포의 대부분의 제거를 허용할 것 이다. 요리에서 세포 현 탁 액을 복구 하 고 50 mL 원뿔 튜브에 붓는 다. 5 분에 대 한 400 x g에서 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한. 펠 릿 캘리포니아2 + 솔루션 회전 아래로 5 분에 대 한 400 x g에서 각 시간에 의해 킬레이트 화 10 mL에 두 번 세척. 0.25%의 5 mL에 펠 릿을 resuspend 트립 신/EDTA와 37 ° c.에 5 분 동안 품 어 상단 트립 신 솔루션 dispase 솔루션의 5 mL을 추가 하 고 보충 DNase I 1μg/mL. 1 mL-팁 DNA 덩어리를 세분화 하 고 모든 3 분 떨고 37 ° C에서 10 분 동안 품 어을 통해 적어도 5 배 아래로 플라스틱. 40 μ m 셀 스 트레이너를 통해 새로운 50 mL 원뿔 튜브에서 세척 매체 # 2의 10 mL와 필터를 추가 합니다. 5 분에 대 한 400 x g에 세포 현 탁 액 아래로 회전 시키십시오 그리고 모든 액체를 제거 하는 상쾌한 삭제. FACS에 의해 유 방 상피 세포의 정화 10 μ를 추가 하 여 항 체 혼합 준비 린 (마우스 리니지 항 체 칵테일), 12 μ 안티-CD326 (Ep-캠) 최종 농도 30 ng/mL, 10 μ 안티-CD49f, 25 ng/mL, 10 ng/mL의 최종 농도 10 μ 안티-CD61의 최종 농도에 하 2.5 μ 안티-CD29, 2.5 ng/mL의 최종 농도에.참고: 1.3이 단계 단계에서 항상 붙일 레이블된 항 체의 표백 피하기 위해 어둠 속에서 작동. 각 펠 릿에 대 한: 별도 튜브에 세포의 작은 수 (펠 릿에서 100 μ 팁 찍기)에 의해 유지. FACS 튜브에 솔루션을 정렬의 500 μ 셀 resuspend 고 얼음 FACS 절차에 대 한 레이블이 없는 샘플으로 계속. 각 펠 릿을 세척 매체 # 1의 200 μ에 resuspend 하 고, 항 체 혼합의 44.5 μ를 추가 하 고 철저 하 게 플라스틱 한 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 품 어. 세척 매체 # 1의 10 mL에 세포 현 탁 액을 희석 하 고 5 분 동안 400 x g에서 스핀 다운 삭제는 상쾌한. 솔루션 분류의 2 개 mL에 셀 펠 릿 resuspend와 모자 거르는 FACS tubeand 통해 필터 FACS-분리 ( 그림 1B)로 세포 인구에. 다 색 FACS 프로토콜을 수행 하기 전에 각 사람의 각 형광 색소의 가능한 다른 일에 대 한 수정 해야 합니다. 이렇게 하려면 셀 서 스 펜 션와 별도로 각 fluorophore 활용 된 항 체를 품 어 하 고 보상 행렬을 만들기 위해 모든 fluorophores 단색 컨트롤을 통해 모든 감지기에서 스펙트럼 중복 값을 측정 한다.참고:이 실험에서 다소 85 μ m 노즐을 갖춘 고용 되었다. 10 여성 쥐에서 일반적인 준비 약 800000 보장할 LD 셀. FACS 절차 동안 수 풀 형성 하는 경우 보조 여과를 진행 합니다. 기본 유 방 LD 셀의 시드 FACS 절차 동안 코트 콜라겐 멀티 잘 조직 배양 플레이트 나 코팅 솔루션. 37 ° C에서 1 시간, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에서 품 어. 코팅 솔루션을 제거 하 고 세척 매체 #1 도금의 바로 전에 세척. 세척 솔루션 # 1의 10 mL와 FACS 절차에서 복구 하는 세포를 세척 하 고 스핀 5 분에 대 한 400 x g 다운 상쾌한 제거. 유 방 2D 문화 매체 (500 µ L/잘) 및 콜라겐 치료 플레이트에 셀 펠 릿 resuspend 적절 한 셀 첨부를 확산 있도록 48 h에 대 한 셀 문화 인큐베이터에 앉아 셀을 하자.참고:는 일반적인 정렬 10 여성 쥐에서 24-잘 멀티 잘 플레이트의 6-8 우물 최적의 셀 밀도 (100 000 셀/잘)를 얻을 것입니다. YMaSCs (유 방 줄기 세포 유도 하는 YAP)의 유도참고:이 단계 이후부터 모든 절차는 BSL-2 조건 하에서 수행 되어야 합니다. 유 방 식민지 매체를 준비 합니다. 갓 셀 뿌리기 직전 매체에 지하실 멤브레인 매트릭스를 추가 합니다. 혈 청 무료 유 방의 두 개의 볼륨으로 한 양의 FUdeltaGW rtTA 바이러스 상쾌한, FUW-tetO-얍 (TAZ) 상쾌한의 하나의 볼륨을 혼합 하 여 transduce 기본 LD 셀 lentiviral 감염으로 유도 하는 YAP 유 방 줄기 세포 (yMaSCs)의 유도 대 한 보충, 500 mL의 총 볼륨에서의 2D 문화 매체 2 배 농도 48 h lentiviral supernatants 셀을 품 어. 전형적인 lentiviral 준비 온라인 프로토콜22를 참조 하십시오. 감염 후 부착 세포를 세척 하 고 2 µ g/mL doxycycline exogenous 얍 (TAZ) 유전자 발현을 유도 하는 것으로 보충 하는 유 방 2D 문화 매체와 치료. 셀 비어, EGFP 또는 YAPS94A 표현 벡터, 또는 유도할 수 있는 야프 (TAZ) 벡터, 감염 세포에 감염을 사용 하지만 부정적인 컨트롤로 doxycycline 없이 왼쪽.참고: 성공적인 감염 수 확인 qRT-PCR transgene 인간 짖 에 대 한 특정 한 뇌관으로 하 여 앞에서 설명한1. 부착 세포 0.05%를 가진 외피 분리 doxycycline와 유도의 7 일 후 트립 신/EDTA (150 μ/잘) 37 ° C에서 10 분 1: 5을 세척 매체 #2 (600 μ/잘)을 diluting 하 여 trypsinization를 중지 하 고 셀. 2 μ g/mL doxycycline와 셀/잘 24-잘 ultralow 첨부 파일 접시에에서 1000의 clonogenic 조밀도에 씨앗 보충 각 잘 (1 mL), 유 방 식민지 중간에 셀 resuspend참고: 유 방 식민지 매체 얼음 차가운 지하실 멤브레인 매트릭스 덧셈의 시간에 있는지 확인 합니다. 지하실 막 매트릭스 해야 합니다 항상 도착 후,-20 ° C에 저장 하 고 하룻밤; 4 ° C에서 천천히 해 동 일단 해 동, 그것 항상 처리 되어야 합니다에 얼음, 제조업체의 지침에 따라. 한 번 짖-LD 셀 표현 확산 시작 및 정지 (yMaSC 식민지) MaSC-같은 식민지로 시드 후 (14 일), 계산 성장과 처리 추가 분석 (그림 1C).참고: (1.4.3 포인트)로 부정적인 제어 셀은 단일 셀으로 유지 됩니다. YMaSC 식민지 성장;의 14 일 동안 신선한 유 방 식민지 매체 마다 72 h와 문화를 보충 이렇게 하려면 5% 지하실 멤브레인 매트릭스, 10 배 농도 보충의 보충 없이 유 방 식민지 매체의 약 수를 준비 하 고 1: 10을 각 영역 (예: 100 μ 총 매체의 1 ml에서), 과도 한 희석을 피하기 위해 전체 볼륨 추가 매트릭스 현 탁 액입니다. 하위 yMaSCs의 배양 유 방 식민지 매체에서 기본 식민지를 복구 후 해리와 초기값을 다시 설정 합니다.참고: yMaSC 식민지 얍 재설정 LD 셀에서 파생 된 자체 갱신 용량을 확보 하 고 성공적으로 하위 추가 doxycycline 관리 (즉, 유전자 변형 얍/TAZ의 표현 별도로) 없이 경작 될 수 있다. 준비, 셀 문화 후드 단계 1.4.1 에서처럼 유 방 식민지 매체 및 유 방 organoid 매체. 각 샘플을 수집 하 고 얼음의 초과 볼륨 (10:1)에서 품 어 차가운 HBSS 지하실 멤브레인 매트릭스를 solubilize 위해 얼음에 1 h. 씻어 식민지 3 x 180 x g 5 분 및 얼음에 resuspend에서 centrifuging으로 차가운 HBSS. 0.05 %trypsin / EDTA 단일 세포 현 탁 액을 37 ° C에서 10 분 동안에 식민지를 품 어. 단일 세포 수준으로 완벽 한 분리 되도록 p1000 팁 10 배 아래로 식민지 플라스틱 셀/잘 24-잘 ultralow 첨부 파일 접시에에서 1000의 clonogenic 조밀도에 doxycycline 없이 유 방 식민지 매체 (1 mL 각 잘) 수와 다시 셀. 10-14 일 마다 자체-갱신 평가 절차를 뿌리고이 반복 합니다. 세 번째 통과 하기 전에 yMaSC 식민지 organoid 문화 조건, yMaSC 확장을 강화 하 고 미니-땀 샘, vivo에서 유 방 동맥의 밀접 하 게 연상 bilayered 상피에 조직 자체의 형성을 위한 통로 조직학 조직입니다. 1.5.3 1.5.4 단계에서 유 방 식민지 매체에서 식민지를 복구 합니다. 100% 성장 인자에서 resuspend 식민지 지하실 멤브레인 매트릭스, 매트릭스의 150 µ L에서 24-잘 ultralow 정판의 각 음에 대 한 20-25 식민지의 최대 replate 고려 감소. 37 ° C에서 40 분 셀 문화 인큐베이터에 접시를 품 어 그리고 지하실 멤브레인 매트릭스 고형화 하 고 유 방 organoid 매체의 500 μ와 젤을 오버레이. 몇 일 후에 organoids (그림 1E) 신진 형태로 식민지의 형성에 대 한 확인 합니다. 후에 10-14 일, 통로 또는 프로세스 추가 분석을 위해 organoids. Organoids 문화 통로, 각 샘플을 수집 하 고 얼음의 초과 볼륨 (10:1)에서 배양 하 여 organoids를 복구 차가운 HBSS 지하실 멤브레인 매트릭스를 solubilize 위해 얼음에 1 h. Organoids 3 세척 스핀에 의해 x 180 x g 5 분에서 아래로 하 고 얼음에 resuspend 감기 HBSS. 0.05 %trypsin / EDTA 단일 세포 현 탁 액을 37 ° C에서 10 분 동안에 organoids를 품 어. 단일 세포 수준으로 완벽 한 분리 되도록 p1000 팁 10 배 아래로 organoids 플라스틱 100% 증가율 감소 지하실 멤브레인 매트릭스 (24-잘 ultralow 정판의 각 잘 150 μ)의 한 방울에 단일 셀 서 스 펜 션으로 다시 시드하십시오. 지하실 막 매트릭스 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 40 분을 배양 하 여 젤을 형성 하 고 유 방 organoid 매체의 500 μ와 젤 오버레이 하자.참고: yMaSC organoids 단계 1.5.13, trypsinization를 피하에서 100% 지하실 멤브레인 매트릭스 문화에서 복구 하 여 cryopreserved 수 있습니다. 10 %DMSO 보충 유 organoid 매체에 저장 합니다. 신속 하 게 동결-80 ° C에서 yMaSC organoids와 다음 액체 질소에 보존. 2입니다. yDucts 세대 참고: 모든 미디어와 솔루션 구성 섹션 2는 표 2에 지정 됩니다. 주 췌 acini의 절연 70% 해 부 집게와가 위 배치 EtOH 셀 문화 후드 포상 문화 매체, 각 마우스;에 대 한 15 mL에서 준비 포상 복구 매체, 각 마우스; 60 mL PBS/PS; 재고 솔루션 콜라 나; 콜라 나 솔루션, 각 마우스;에 대 한 15 mL 쥐 꼬리 콜라겐 무력화 나 솔루션. 쥐 꼬리 콜라겐 중화 나 pH = 7, 어 얼음에 모든 시 약을 그것을 중화 쥐 꼬리 콜라겐 PBS/ps. 계속에 있는 교원 질 용 해, 그리고 10N HCl. Dilute 2.5 mg/ml와 아세트산 버퍼링을 0.1 N NaOH와 함께 먼저 조정 하 여. 6 적절 한 유전자 형의 9 주 된 쥐를 희생. 그것의 뒤에 각 마우스를 놓고 70% 에탄올 솔루션으로 복 부를 세척 합니다. 복 부 벽을 따라 절 개를 경도 확인 합니다. 및 (사용 하 여 비장 가이드로) 췌 장 해 부 찾아서 10 mL 얼음에 10 cm 비 세포 접착 요리에 차가운 PBS/ps. 전송 셀 문화 후드 즉시 요리. 이 단계 이후, 셀 문화 후드 항상 작동 합니다. 새로운 비-셀에 각 췌 전송 접착제 접시 이전 가득 콜라의 7 mL 나 솔루션 1. 신속 하 게 약 1 m m3 파편의 균질 조직 정지를 일회용 scalpels의 한 쌍 각 췌를 말하다.참고:이 절차 최적의 세포 생존 능력에 대 한 더 이상 2 분 걸릴 한다 중요 하다. 37 ° C에서 콜라 소화, 5% CO2 10 분, 균질 성 조직 소화를 보장 하기 위해서 모든 3 분 떨고 셀 문화 인큐베이터에 접시를 품 어. 50 mL 원뿔 튜브 (각 췌 하나) 소화 조직 복구, 포상 세척 매체의 10 mL와 접시 세척 같은 50 mL 원뿔 튜브에, 이상의 3 배 아래로 조직 소화 pipetting. 100 x g 18 ° C에서 5 분에 대 한 소화 조직을 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한.참고:이 단계 동안 콜라 활동 낮은 18 ° C에서 셀 아래로 회전 합니다. 조직 resuspend 펠 렛 7 mL 콜라에에서 나 솔루션 및 새로운 10 cm 비 세포 접착 접시에이 솔루션을 부 어. 콜라 소화 단계 2.1.5, 떨고 동종 조직을 소화를 보장 하기 위해서 모든 3 분에서 10 분 동안 37 ° C에서의 두 번째 라운드에 대 한 요리를 품 어. 한편, 100 μ 셀 스 트레이너로 각 췌 한 깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브 준비. 소화 조직을 복구 하 고 macerating 살 균 10 mL 주사기 플런저 (전단 힘 여과기 표면에 접선을 피하 조직, 신중 하 게 눌러 있는지 확인)를 조직 하 여 100 μ 셀 스 트레이너를 통해 전달 합니다. 포상 세척 매체의 10 mL와 함께 접시를 세척 하 고 동일한 100 μ 셀 스 트레이너가 10ml를 통과. 100 x g 18 ° C에서 5 분에 대 한 소화 조직을 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한. 포상 세척 매체의 10 mL와 함께 조직 펠 릿을 복구 합니다. 이미 포함 된 신선한 포상 세척 매체의 추가 10 mL, 물의 resuspension의 펠 릿에 대 한 과도 한 pipetting 피하고 50 mL 원뿔 튜브에 셀 솔루션을 전송 합니다. 100 x g 18 ° C에서 5 분에 대 한 소화 조직을 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한. 조심 스럽게 소화 조직 포상 복구 매체의 6 ml에서 resuspend 하 고 6-잘 멀티 잘 조직 문화 접시, 3 mL의 2 우물에 그것을 배포. stereomicroscope에서 신중 하 게 평가 포상 격리의 품질 단일 셀 ( 그림 2B참조);의 작은 비율과 포상 클러스터의 동종 중단으로 나타나는 어떤 큰 조직을 제거 덩어리 결국 제시 (일반적으로 육안으로도 보이는), 솔루션에서 pipetting으로. 주 췌 acini의 시드 셀 복구 수 있도록 2 h, 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 소화 포상 클러스터를 품 어. 셀 복구 코트 동안 48-잘 멀티 무력화 쥐 꼬리 콜라겐의 100 μ와 웰 스 하 고 양식에 히드로 쿠션 수 있도록 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간에 품 어. 후 세포 복구, 2 h 포상 세포 현 탁 액 원뿔 튜브에 수집, 18 ° C에서 100 x g에 5 분 동안 스핀 다운 하 고는 상쾌한을 제거 합니다. 포상 문화 매체 (150 μ 48 잘 조직 배양 플레이트의 각 음에 대 한)의 적절 한 볼륨에는 acini resuspend. 각 씨는 최적의 밀도 (100-120 포상 클러스터/잘)를 16 우물에 췌 장을 해리 했다. 희석 중화 쥐 꼬리 콜라겐의 동등한 양으로이 포상 일시 중지 나 솔루션, 얼음에 튜브를 유지. 신중 하 게 혼합 하 고 신속 하 게 씨앗 2.2.2 (300 μ 48 잘 멀티 잘 조직 배양 플레이트의 각 음에 대 한)에 설명 된 콜라겐 쿠션 위에 세포 현 탁 액. 양식에 히드로 있도록 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간을 품 어. 췌 장 organoids의 유도 500 μ의 포상 문화 매체 R26-rtTAM2;에서 췌 장 organoids의 야프-종속 유도 2 μ g/ml doxycycline 보충으로 콜라겐 hydrogels 오버레이 TetO 얍S127A 쥐; 네거티브 컨트롤 wt 셀 교양된 같은 조건 또는 R26-rtTAM2;에 의해 제공 됩니다. TetO 얍S127A doxycycline의 부재에서 경작 하는 세포. 문화 포상 세포 포상 문화 매체에서 2 μ g/mL doxycycline 상쾌한 문화 매체 (300 μ/잘) 모든 48 h organoid 형성 ductal 같은 구조 ( 를 형성 하는 낭종으로 형태학 적 변화에 의해 다음 5 ~ 7 일에 대 한 보충 그림 2C). 세포를 췌 장 organoid 문화 조건에 passaged 또는 추가 분석에 대 한 수확 수 있습니다 organoids 형성 되 면 (예: RNA 추출, 면역 형광 검사). 하위 췌 장 organoids의 배양 그들의 자기 재생 능력을 평가, clonally 유도 하는 YAP 췌 장 organoids (yDucts) 외 인 얍/TAZ 공급 (즉별도로 3 차원 지하실 멤브레인 매트릭스 hydrogels (췌 장 organoid 문화 조건)에 통행. doxycycline 관리는 별도로). 트립 신 준비 0,05%/EDTA; 100% 증가율 감소 지하실 멤브레인 매트릭스; 췌 장 Organoid 매체와 콜라 나 솔루션 b. 준비 15 mL 원뿔 튜브 콜라의 4 mL 나 솔루션 B passaged 수를 각 잘. 문화 매체를 버리고, 신중 하 게 부드러운 포부에 의해 hydrogels 우물에서 추출 하 고 원뿔 튜브에 그들을 전송. 콜라겐 매트릭스 (체크는 히드로 solubilized 완전히 때까지 각 10 분)의 완벽 한 소화 수 있도록 지속적인 활기찬 동요와 함께 30 분 동안 37 ° C에서 튜브를 품 어. 750 x g 2 분에 복구 된 셀 아래로 회전 시키십시오 고 상쾌한을 제거 합니다. 품 어 트립 신 1 mL에 복구 된 셀 단일 세포 현 탁 액을 37 ° C에서 10 분 동안 0,05%/EDTA. 9 mL PBS 1의와 트립 신을 희석 x 750 x g 2 분 동안에 아래로 회전 하 고 상쾌한 제거. 얼음 차가운 증가율 감소 지하실 멤브레인 매트릭스에서 셀 펠 릿과 매우 낮은 부착 판 (일반적으로 24-잘 접시의 한 잘에서 150 μ의 드롭)에 씨앗을 resuspend. 37 ° C에서 40 분 셀 문화 인큐베이터에 접시를 배양 하 여 고형화 하 고 췌 장 Organoid 매체와 다음 오버레이 지하실 멤브레인 매트릭스 히드로 게 (500 μ 각 잘). yDucts는 7-10 일 (그림 2D) 낭종 같은 organoids로 성장할 것입니다. 더 organoids를 뿌리고 제거할 수 있습니다 지하실 멤브레인 매트릭스에서 얼음 차가운 PBS 1 부 화에 대 한 x 30 분 뒤 세척 하 여 3 번 스핀 다운 5 분 및 얼음 차가운 PBS 1 물의 resuspension 180 x g에서 매트릭스 carryover 피하기 위해 x. Organoids는 다음 단일 셀 정지를 10 분에 대 한 트립 신 0.05% 해리 신선한 지하실 멤브레인 매트릭스에 다시 시드해야 고 췌 Organoid 매체 (2.4.7-2.4.8)로 입혔다. yDuct organoids 단계, 2.4.9 trypsinization, 피하로 100% 지하실 멤브레인 매트릭스 문화에서 복구 하 여 액체 질소에 cryopreserved 수 고 10 %DMSO 보충 췌 Organoid 매체에 저장. yDuct organoids-80 ° C에서 신속 하 게 고정 되며 다음 액체 질소에 보존.

Representative Results

YMaSCs의 생성얍의 과도 식으로 기본 유 방 LD 셀 프로그램을 실험 전략의 개요 그림 1A에 제공 됩니다. 기본 유 방 LD 상피 세포13정렬 형광 활성화 된 세포에 의해 정화 된다. 그림 1B 세 가지 가지 부분 모집단을 얻기 위해 일반적인 정렬 프로시저를 나타냅니다: 기저 세포 (EpCAM낮은CD49f높은CD61-), Luminal 조상 (LP) 세포 (EpCAM높은CD49f낮은CD61+ )와 LD 셀 (EpCAM높은CD49f낮은CD61-). 주의 3 부분 모집단의 게이팅 격리 LD 셀의 순수한 준비 필수, 그는 완전히 분화 하 고 성장 때 유선 식민지 형성 ( 그림 1C, 왼쪽 패널 참조)에서 시드를 체포 하는 완전히. 반대로, exogenous 얍을 표현 하도록 유도, LD 셀 시작 5% 지하실 멤브레인 매트릭스 현 탁 액 문화 (그림 1C)에 쉽게 인식할 수 있는 조밀한 상피 식민지를 확산. 프로그래밍, 효율 인증 약 3%는 전형적인 실험, 원래 지하실 멤브레인 매트릭스 현 탁 액 문화 (그림 1D)에 시드 단일 셀의 수에 식민지의 수를 계산 하 여 득점 될 수 있다. 재설정된 luminal 셀 (yMaSCs) 다음 상태로 100% 지하실 멤브레인 매트릭스 organoid 문화 ( 그림 1A에서 구성표 참조), 스스로 여러 루멘 주위를 개발 하는 복잡 한 organoid 같은 구조로 조직 통과 수 고 doxycycline (즉 유전자 변형 얍 식의 부재에서)의 부재에도 놀라운 자기 재생 능력을 표시 (그림 1E). 조직학, yMaSC에서 파생 된 organoids 표시 기저 레이어 (긍정적인 K14), ECM 및 luminal 레이어 (K8 긍정적인), organoid (그림 1 층) 내에서 루멘 모양의 구멍을 직면 하 고 재구성 지하실 멤브레인 매트릭스를 직면 하 고. 이 아키텍처는 네이티브 MaSCs (그림 1 층)에 의해 형성 하는 organoids의 저것에서 구별할 수 없습니다. YDucts의 생성주 췌 acini 야프의 과도 식으로 프로그램을 실험 전략에 대 한 개요는 그림 2A에 표시 됩니다. 전체 포상 클러스터 온화한 분리 및 여과 통해 크기 배제의 조합에 의해 췌 장 조직의 대부분에서 격리 됩니다. 일반적인 준비는 그림 2B에서 제공 됩니다. 절연, 포상 세포 클러스터 exocrine 포상 단위의 균질 크기, 내 분 비 Langerhans islets 또는 췌 장 ductal 트리와 단일 셀에 최소한의 분리의 조각에 의해 오염 없이의 정지로 표시 됩니다. 내 분 비 작은 섬 또는 ductal 파편 오염은 가혹한 처리;으로 인해 부족 한 선택적 여과 (2.1.10 단계)의 표시 단일 셀에 포상 클러스터의 원치 않는 분리 추가 SBTI 치료 curbed 수 조직에 의해 발표 하는 분해 효소의 과도 한 콜라 치료 또는 버퍼링으로 인해 수 있습니다. 전형적인 포상 재활 실험은 그림 2C; 제시 3D 콜라겐에서 문화의 5-7 일 이내-히드로 doxycycline 존재를 기반으로, 췌 장의 acini R26-rtTAM2/tetO-얍S127A 마우스에서 쉽게 파생 덕트 같은 클러스터로 얇은 작곡 (그 우리 라는 yDucts), 확장 중앙 구멍 주위 확산 상피 세포의 단층. 약 70% 인 전형적인 실험에 대 한, 재활 효율성 시드 acini (그림 2D)의 총 수에 덕트 같은 클러스터 수를 득점으로 쉽게 측정할 수 있습니다. 부정적인 통제 세포, 즉 R26-rtTAM2 / + 셀 또는 R26-rtTAM2/tetO-얍S127A 셀 왼쪽 doxycycline, 하지 않고 변함없이 유지 하지 이러한 문화 조건에, 이전 보고1 포스트 mitotic 포상 클러스터로 ,,1415. 있으 나 재설정된 yDucts Matrigel 기반 organoid 문화 조건16 으로 단일 세포 수준에서 다음 passaged 될 수 있다 ( 그림 2A에서 구성표 참조), doxycycline (즉 의 부재에도 놀라운 자기 재생 능력을 표시 유전자 변형 얍 식의 부재)에서 (그림 2E). 그림 1: 기본 유 방 LD의 고립 세포와 유도의 유 방 줄기 세포. (A) 실험 절차의 도식 표현 기본 유 방 LD 셀 프로그램을 채택 했다. (B) 대표 FACS-구획 전형적인 정렬 절차를 보여주는 LD 세포를 정화. i) 천연된 셀 고 측면 분산형 라이브 셀 (P1; 블루);에 따라 문이 ii) 인구 P1의 린 프로 파일에 따라 추가 문이 다음: 혈통 부정적인 세포 (P2; 그레이)의 부분 모집단 선택 제외 혈통 긍정적인 조 혈 모 세포; 3) 인구 P2 다음는 EpCAM높은 (P3, 옐로우 + 그린)와 EpCAM낮은 (P6, 레드) 모집단;으로 구분 4) P3, P6는 다음 추가 문이 그들의 CD61/CD49f 프로 파일에 따라 3 개의 모집단으로: EpCAM낮은CD49f높은CD61- 기저 세포 (P7, 레드), EpCAM높은CD49f낮은CD61+ LP 셀 (P8, 노랑) 그리고 EpCAM높은CD49f낮은CD61- LD 셀 (P9; 녹색). (C) 이미지는 유 방 식민지 매체에 뿌리기 후 15 일 유 방 식민지를 형성 하는 LD 셀, 지정 된 구조와 감염의 기능 설명입니다. 식민지 형성으로 셀 턴 얍 표현 셀, 반면 부정적인 제어 (EGFP 감염) 세포 유지 성장 체포 단일 셀으로. 눈금 막대 = 50 μ m. (D) (C)에서 표시 된 셀의 능력을 형성 하는 식민지의 정량화. 데이터 의미 + 사 우 스 다코타 제시 되며 각각 6 기술 복제 5 개의 독립적인 실험의 대표. (E) 얍 재설정 유 방 줄기 세포와 같은 세포 (yMaSCs) 상태로 organoid 문화에 신선한 3 차원 100% 지하실 멤브레인 매트릭스 히드로 부재에 Doxycycline의 12 일 후의 대표 이미지. 눈금 막대 100 μ m =. (F) organoids의 (레드) luminal 마커 K8 기저 마커 K14 (녹색)에 대 한 대표적인 면역 형광 이미지 organoid 문화 조건에 12 일 후에 하는 지정 된 셀에서 파생 된. 눈금 막대 = 10 μ m. 이 그림은 Panciera 그 외 여러분, 20161에서 재생 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 : 기본 췌 장 acinar 세포 및 췌 장 창시자의 유도의 격리. (A) 실험 절차의 도식 대표 주 췌 exocrine 포상 세포를 프로그램을 채택. (B) 기본 췌 acini 격리 절차 (단계 2.1.14) 직후의 대표 이미지. 포상 준비 포상 클러스터의 균질 정지로 단일 셀의 최소한의 존재와 함께 나타납니다. 눈금 막대 = 400 μ m. (C) 기본 췌 acini의 대표 이미지 R26-rtTAM2 (위 패널)에서 파생 된또는 R26-rtTAM2; tetO 얍S127A (낮은 패널) 쥐 나 3 차원 콜라겐에 경작 하 고-함께 또는 없이 5 일 동안 하이드로 겔을 기반으로 Doxycycline (doxy), 표시 된 대로입니다. 만 주 acini 얍 표현 Doxycycline 추가 후 낭종 같은 organoid로 성장 하는 셀을 변환 합니다. 스케일 바 = 70 μ m. (D) (C)와 같이 유전자 변형 얍 overexpression에 ductal organoids를 형성 하는 췌 장 acini의 기능의 정량화. 데이터 의미 + 사 우 스 다코타 제시 되며 4 개의 기술 복제 수행 5 개의 독립적인 실험의 대표. (E) 얍 reprogramed ductal 같은 셀 (yDucts) 후 신선한 3 차원 100% 지하실 멤브레인 매트릭스 히드로 Doxycycline의 부재에 3 구절의 대표 이미지. 눈금 막대 = 130 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 기본 유 방 세포의 고립 캘리포니아2 + 해결책 킬레이트 화 4 ° C에서 저장소 EDTA 0.02 %w / V PBS 콜라겐 코팅 솔루션 나 초 산 0.02N, pH 3,23 쥐 꼬리 콜라겐 (코팅) 1:50 Dispase 솔루션 4 ° C에서 저장소 Dispase 5 mg/ml PBS 분리 매체 DMEM:F12 Hyaluronidase 재고 솔루션 400 U/mL 펜/Strep 1 x 재고 솔루션 콜라 나 600 U/mL Haemolytic 솔루션 4 ° C에서 저장소 NH4Cl 솔루션 1 부품 TrisBase 20.6 g/L 9 부품 pH 7.2 조정 HBSS/PS 4 ° C에서 저장소 HBSS 펜/Strep 2 x Hyaluronidase 재고 솔루션 0.2 µ m 필터, 4 ° C에서 저장 소 고환 (분말)에서 hyaluronidase 2000 U/mL 나트륨 인산 염 버퍼 1 M pH7.3 NH4Cl 솔루션 T. amb에 저장 합니다. H2O NH4Cl 7.1 g/L 7.65에 pH를 조정 솔루션을 정렬 0.2 µ m 필터, 4 ° C에서 저장 BSA 0.1% EDTA 1mm HEPES pH 7 25 m m PBS 세척 매체 #1 DMEM/F12 펜/Strep 1 x 세척 매체 #2 DMEM/F12 FBS 5% 펜/Strep 1 x 유 방 2D 문화 매체 DMEM/F12 FBS 2% 헤 파 린 4 mg/mL L-글루타민 1 x murine bFGF 10 ng/mL murine EGF 10 ng/mL 펜/Strep 1 x 유도 및 yMaSCs의 Passaging 유 방 식민지 매체 DMEM:F12 FBS 5% 헤 파 린 4 µ g/mL L-글루타민 1 x Matrigel (뿌리기 직전 추가) 5% murine bFGF 20 ng/mL murine EGF 10 ng/mL 펜/Strep 1 x 유 방 Organoid 매체 고급 DMEM:F12 B27 1 x GlutaMax 1 x 헤 파 린 4 µ g/mL Hepes 1 x 인간의 머리 100 ng/mL murine bEGF 20 ng/mL murine EGF 50 ng/mL R-Spondin 1 1 µ g/mL 표 1: yMaSCs의 생성. 모든 다른 문화 미디어와 기본 유 방 LD 세포의 분리 및 yMaSCs (제 1)의 유도에 필요한 솔루션의 구성 주 췌 acini의 절연 문화 매체 포상 BPE 50 µ g/mL BSA 0.1% Dexamethasone 1 µ g/mL FBS 0.1% 그것의 X 1 x 펜/Strep 1 x SBTI 0.2 mg/mL Waymouth의 매체 포상 세척 매체 BSA 0.1% 펜/Strep 1 x RPMI 매체 SBTI 0.2 mg/mL 포상 복구 매체 문화 매체 포상 FBS 30% 콜라 나 솔루션 A 포상 세척 매체 재고 솔루션 콜라 나 360 U/mL PBS/PS 4 ° C에서 저장소 PBS (인산 염 버퍼 염 분) 펜/Strep 1 x 재고 솔루션 콜라 나 -20 ° C에서 저장소 콜라, 유형 I (분말) 6000 U/mL PBS 췌 장 organoids의 뿌리고 콜라 나 솔루션 B PBS 1 x 재고 솔루션 콜라 나 240 U/mL 췌 장 Organoid 매체 고급 DMEM/F12 B27 1 x gastrin 10 nM 인간 FGF10 100 ng/mL 인간의 머리 100 ng/mL murine EGF 50 ng/ml N-진 1.25 m m 니코틴 10 m m 펜/Strep 1 x R-Spondin 1 1 mg/mL SBTI 0.2 mg/mL 표 2: yDucts의 생성. 모든 다른 문화 미디어와 yDucts (제 2)의 뿌리고 주 포상 세포와 유도의 격리에 필요한 솔루션의 구성

Discussion

여기 선물이 그들의 해당 조직의 특정 조상 세포 (또는 ySCs)로 다른 조직의 비보 전 말기 분화 상피 세포를 프로그램을 프로토콜 얍의 과도 식으로 보고 이전1. 우리 두 절차 세부: lentiviral 벡터와 두 번째 하나는 바이러스 감염을 방지 하 고 유전자 변형 얍 식의 활용을 통해 셀 FACS 정화의 프로그래밍 허용 하나. 각 프로토콜 효율적인 전략을 제시 하 고 문화 기본 차별화 된 세포와 세 하 전략 짖 차별화 된 세포에 유전자 발현에 드 노 보 체세포 조직-특정 확장 줄기 세포 (참조 생성 그림 1A2A음모).

우리는 우리가 결코 부정적인 컨트롤 샘플 (그림 1C2c)에서 어떤 결과 감지 하는 사실에 의해 증명 여기 제시 효과적으로 격리 전략의 차별화 된 셀의 순수한 인구 격리 시연 했다.

기본 유 방 LD 셀의 프로그래밍에 대 한이 연구에 사용 된 lentiviral 벡터 doxycycline 유도할 수 있는 transgene 식;의 꽉 컨트롤의 가능성을 제공 하는 이 설정에 있으며 exogenous 얍 오프에 식을 것 이다. 특히 주의 프로그래밍 효율성 측면에서 해로운 수 과도 한 바이러스 titer의 사용을 피하에 두어야 한다. 주요 포상 세포의 경우 우리는 최소한의 조작으로 얍 따라 프로그래밍를 완전히 유전자 변형 방법 전환. 이 후자의 전략도 고립 된 포상 클러스터는 거의 순종 lentiviral 감염 하 고 매우 깨지기 쉬운 기본 췌 acini 특히 적합 이다. 유전자 변형 전략 고용 유전자 발현의 꽉 컨트롤 doxycycline 종속 lentiviral 벡터의 동일한 이점을 제공 합니다. 또한, 유전자 변형 전략 기본 췌 acini와 착취는 훨씬 높은 재활 효율 유 LD 세포의 바이러스 성 유도 프로그래밍에 비해의 추가적인 장점을 맺는 다. 다른 조직에서 파생 된 셀에 연결 된 다른 본질적인 소성 넘어 췌 장 프로그래밍의 더 높은 속도 모두 균일 하 고 자치 얍 식에 연관 된 식의 높은 효율에서 파생 될 수 있습니다. explanted 셀입니다. 특히, 우리는 외 인 야프는 더 이상 필요 (yMaSC 식민지 그리고 yDucts), ySCs의 생성 후 자신의 자기 재생 능력을 영향을 주지 않고 증명 하고있다. YSCs 생 얍/TAZ를 다시 활성화 하 고 꺼지면 exogenous 얍1자기 갱신에 대 한 그들을 사용 하는 때문입니다.

우리는 ySCs 유전자 계보 추적 유효성 검사1통해 우리의 재활 실험의 원래 셀을 제어 하 여 차별화 된 세포에서 실제로 등장 하는 개념 검증.

광범위 한 특성ySCs의 표시는 일반 체세포 SCs1 로 생성 프로그래밍 유도 하는 YAP) transcriptomic 수준에서 ySCs 네이티브 SCs;와 대규모 중복 표시 ii) ySCs 감 별 법 잠재력을 표시 하 고의 그들의 조직의 정체성을 항상 제한 multilineage 자손을 생성할 수 있습니다. ySCs iii) 변형 비 고 비 tumorigenic 때 생체 내에이식.

여기 우리 또한 유지 하 고 문화에 확장 하는 절차를 설명 100% 지하실 멤브레인 매트릭스 hydrogels에 포함 된 yMaSCs와 organoids로 yDucts. 자기 조직에 대 한 이러한 조건이 허용 stemness 속성 장기 문화에의 유지 보수를 보장 하는 3 차원 organoids에 ySCs의 다운스트림 분석 및 응용 프로그램에 대 한 것입니다 인구 줄기 이러한 확장을 사용. 알 수 없는 이유로, 우리는 yMaSC를 실패 했습니다 배치 하 여 organoids 감염 organoid 문화 조건에 직접 LD 셀 플라스틱 조직 문화 접시; doxycycline 치료 후 7 일 즉, 유 방 식민지 상태에서 중간 성장 단계는 필수적입니다. 우리의 손에 네이티브 MaSCs organoid 문화에 뿌리고 전에 유 방 식민지 상태를 요구 한다. 또한, 가장 효율적인 organoid 파생물은 우리가 단일 세포로 기본 식민지를 해리를 방지 하지만 오히려 organoid 문화 조건에 그대로 식민지를 전송 때 얻어진 다.

Organoid 문화 조건 또한 ySCs, cryopreserve에 organoids cryopreservation 질소 목욕에 있는 이전 셀 분리를 피하고 그들의 행렬에서 복구 되는 주는 장점은 곰.

제시 하는 절차를 프로그래밍 하는 얍 (우리는 테스트 유 방, 췌 장 및 신경 세포를 사용 하 여) 그들의 해당 조직 관련 줄기 세포로 다른 성인 조직에서 파생 하는 뚜렷한 차별화 된 셀 형식을 변환할 수 있습니다1. Ipsc 또는 기타 재활 노력에서 차이에서 얍/유도 SCs 근원의 그들의 직물의 기억을 유지할 수 있다. 메모의 세포 줄기 같은 속성 부여로 체세포의 탈 분화 세포 운명 소성의 유일한 형태 이다 하 고 상처 치유5,17 을 지원 하 고 조직 손상 후 예 vivo에서 관찰 프로그래밍 , 18 , 19 , 20. 그것은 주목할 만한 야프와 TAZ는 크게 일반 항상성 위해 불가결 하지만 여러 조직11,21조직 수리를 위해 중요 한. 일관 되 게 여기 설명 된 재활 단계의 생리 적 기능, 얍/TAZ 최근 표시 되었습니다 발생으로 성인 장 셀의 변환 하 여 궤 양성 대 장 염 환자의 마우스 모델에서 장 재생에 필요한 것으로 태아 창 자19의 기능을 표시 하는 수리 상피 지금까지 시험관을 잡으려고 도전 상태 체세포 줄기 세포를 생성 하는 수단을 제공 하 여 현재 유도 셀 소성 전략 확장 따라서 얍 프로그래밍 합니다. 이 방법은 또한 인간 파생 셀에 확장 하는 경우 체세포 stemness 상태의 연구 재생 의학 응용 프로그램에서 광범위 한 관련 되 고 체세포의 확장을 위한 줄기 세포에 생체 외에서.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 tetO 얍S127A 마우스;의 선물에 감사 F. 카 마르고 R26-rtTAM2 마우스 (주식 #006965)는 잭슨 실험실에서 구입 했다. 우리는 키 아 라 Frasson와 주세페 바소 FACS 절차에 대 한 감사. 이 작품 AIRC 특별 프로그램 분자 임상 종양학 ‘mille 당 5 ‘에 의해 지원 되 고는 AIRC PI-그랜트 머리글, 그리고 Epigenetics 플래그십 프로젝트 CNR Miur S.P.에 부여 이 프로젝트는 유럽 연합의 수평선 2020 연구 및 혁신 프로그램 (부여 계약 DENOVOSTEM No. 670126)에서 유럽 연구 회의 (ERC)에서 자금을 받았다.

Materials

10 mL sterile syringes Rays 10LC
100 mm  cell strainer Corning 352360
15 mL sterile conical tubes Corning 430052
24-well ultra low attachment plates Costar 3473
40 mm cell strainers Corning 352340
48-well multiwell plates Corning 353078
50 mL sterile conical tubes Corning 430290
6-well multiwell plates Corning 353046
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634028
B27 supplement (50x) Gibco 17504001
BPE Gibco 13028014
BSA Sigma A9418
Collagenase, type I Sigma 17018029
dexamethasone Sigma D4902 
Dispase Gibco 1705-041
Disposable scalpels Swann-Morton 0503
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO Sigma D2650
DnaseI Roche 11284932001
doxycycline hyclate Sigma D9891 
EDTA Sigma E5134
Ethanol 100% Sigma 51976
FACS tubes (with strainer caps) Falcon 352235
FBS Gibco 10270106
FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) BioLegend 118208
FUdeltaGW-rtTA  Addgene  #19780 
FUW-tetO-EGFP Addgene  #84041 used as negative control
FUW-tetO-MCS Addgene  #84008 used as negative control
FUW-tetO-wtYAP Addgene  #84009
FUW-tetO-YAPS94A Addgene  #84010 used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant)
GlutaMax Gibco 35050061
HBSS Gibco 24020117
HCl Sigma 30721
heparin sodium salt Sigma H3149 
HEPES buffer solution (1M) Gibco 15630-056
human R-Spondin1 (His Tag) Sino Biological 11083-H08H-5
Hyaluronidase from bovine testes Sigma H3506 
ITS-X Gibco 51500056
K-14 antibody Life Technologies Ab7800 
K-8 antibody Life Technologies Ab14053 
L-Glutamine Gibco  25030081
Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) BD Biosciences 51-9003632
Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free Corning 356231
N-Acetylcysteine Sigma A9165
NaOH J.T.Baker 0402
NH4Cl Sigma A9434 
Nicotinamide Sigma 72340
non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) ROLL 18248
PBS 10x Euroclone ECM4004XL
PE Hamster Anti-Mouse CD61 BD Biosciences 553347
PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f BD Biosciences 551129
PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody BioLegend 102222
Pen/Strep (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Rat Tail Collagen I (coating) Sigma 122-20
Rat Tail Collagen I for 3D culture Cultrex 3447-020-01 
recombinant human FGF10 Peprotech 100-26
recombinant human Noggin Peprotech 120-10C
recombinant murine EGF Peprotech 315-09
recombinant murine FGF basic (bFGF) Peprotech 450-33
RPMI 1640 medium Gibco 31870025
SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) Sigma T6522 
Tris BASE  Roche 11814273001
Trypsin-EDTA 0,05% Gibco 25300054
Waymouth medium Gibco 31220023

References

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Citer Cet Article
Panciera, T., Azzolin, L., Di Biagio, D., Totaro, A., Cordenonsi, M., Piccolo, S. De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ. J. Vis. Exp. (135), e57462, doi:10.3791/57462 (2018).

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