드 노 보 그렇 구나/TAZ에 의해 체세포 줄기 세포의 생성

우리의 기관 지침을 준수 하 고 OPBA 및 건강의 교육부에 의해 승인 모든 동물 절차 수행 했다 1. 야프 유도 유 방 줄기 모양의 셀 (yMaSCs)의 생성 참고: 모든 미디어와 솔루션 구성 섹션 1 표 1에 지정 됩니다. 기본 유 방 세포 인구의 절연 셀 문화 후드 준비: 일회용 scalpels hyaluronidase 솔루션, 분리 매체, hemolytic 솔루션, 정렬 솔루션, 내가 코팅 솔루션, 캘리포니아2 + chelating 솔루션, 세척 매체 #1 세척 중간 #2, dispase 솔루션, 콜라겐 유 방 2D 문화 매체, 얼음 차가운 HBSS/추 전형적인 실험에 대 한 희생 10 여성 쥐 (CD-1 C57BL/6 스트레인의), 8-12 주 오래 된 자 궁 경부 전위에 의해. 절 개 전에 풍부한 70% 에탄올 솔루션으로 복 부를 소독. 복 부 피부 따라 Y 자 모양의 절 개를 하 고 신중 하 게 Dumont 집게로 살짝 당겨 복 막에서 동맥을 분리 하 여 유 방 동맥 해 부. 해 부 동맥 10 mL 얼음 비 세포 접착 접시에 놓고 차가운 HBSS/PS (각 요리에 대 일 분 비), 모든 피부 부분이 월 하지 않아야 함. 조직 문화 후드 신선한 HBSS/PS의 10 mL에 각 선을 한 번 세척 하 고는 빈 셀이 아닌 접착제 요리 (각 요리에 대 일 분 비)에 배치 합니다. 셀 것 이다 그들에 게 충실 하는 경향이 조직 문화 접시를 사용 하지 않는 재료의 상당한 손실을 일으키는 원인이 되. 1 m m3 파편의 균질 성 혼합 얻을 때까지 가늘게 scalpels와 유 방 땀 샘을 말하다. 막힘 방지를 적어도 5 x 세분화 조직 덩어리를 pipetting 50 mL 원뿔 튜브에 정지를 전송 25 mL 혈 청 학적인 피 펫과 분리 매체의 10 mL에 각 접시에서 다진된 조직을 복구 합니다.참고: 효율적인 소화 단계 1.1.5에서에서 조직의 적절 한 닦지 중요 하다. 연속 활기찬 동요와 37 ° C에서 1 시간에 품 어. 1 시간 후에 homogenate를 확인 하 고 수 풀은 여전히 존재 하는 경우 부 화 10 분 연장. 실 온에서 5 분에 대 한 400 x g에서 소화 조직을 아래로 회전 시키십시오 그리고 삭제는 상쾌한. 3 ml hemolytic 솔루션의 조직 펠 릿을 resuspend 하 고 얼음에 3 분을 품 어.참고: 혈 이므로 오히려 가혹한 처리, 엄격한 타이밍은이 단계에서 중요 한. 세척 매체 # 1의 10 mL로 세포를 세척 하 고 스핀 5 분에 대 한 400 x g에서 소화 조직 다운 삭제는 상쾌한. 세척 매체 # 2와 10cm 조직 문화 접시에 접시의 10 mL에 조직 펠 릿을 resuspend. 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간을 위한 요리를 품 어.참고:이 단계는 문화 접시에 고착 해야 하는 섬유 아 세포의 대부분의 제거를 허용할 것 이다. 요리에서 세포 현 탁 액을 복구 하 고 50 mL 원뿔 튜브에 붓는 다. 5 분에 대 한 400 x g에서 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한. 펠 릿 캘리포니아2 + 솔루션 회전 아래로 5 분에 대 한 400 x g에서 각 시간에 의해 킬레이트 화 10 mL에 두 번 세척. 0.25%의 5 mL에 펠 릿을 resuspend 트립 신/EDTA와 37 ° c.에 5 분 동안 품 어 상단 트립 신 솔루션 dispase 솔루션의 5 mL을 추가 하 고 보충 DNase I 1μg/mL. 1 mL-팁 DNA 덩어리를 세분화 하 고 모든 3 분 떨고 37 ° C에서 10 분 동안 품 어을 통해 적어도 5 배 아래로 플라스틱. 40 μ m 셀 스 트레이너를 통해 새로운 50 mL 원뿔 튜브에서 세척 매체 # 2의 10 mL와 필터를 추가 합니다. 5 분에 대 한 400 x g에 세포 현 탁 액 아래로 회전 시키십시오 그리고 모든 액체를 제거 하는 상쾌한 삭제. FACS에 의해 유 방 상피 세포의 정화 10 μ를 추가 하 여 항 체 혼합 준비 린 (마우스 리니지 항 체 칵테일), 12 μ 안티-CD326 (Ep-캠) 최종 농도 30 ng/mL, 10 μ 안티-CD49f, 25 ng/mL, 10 ng/mL의 최종 농도 10 μ 안티-CD61의 최종 농도에 하 2.5 μ 안티-CD29, 2.5 ng/mL의 최종 농도에.참고: 1.3이 단계 단계에서 항상 붙일 레이블된 항 체의 표백 피하기 위해 어둠 속에서 작동. 각 펠 릿에 대 한: 별도 튜브에 세포의 작은 수 (펠 릿에서 100 μ 팁 찍기)에 의해 유지. FACS 튜브에 솔루션을 정렬의 500 μ 셀 resuspend 고 얼음 FACS 절차에 대 한 레이블이 없는 샘플으로 계속. 각 펠 릿을 세척 매체 # 1의 200 μ에 resuspend 하 고, 항 체 혼합의 44.5 μ를 추가 하 고 철저 하 게 플라스틱 한 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 품 어. 세척 매체 # 1의 10 mL에 세포 현 탁 액을 희석 하 고 5 분 동안 400 x g에서 스핀 다운 삭제는 상쾌한. 솔루션 분류의 2 개 mL에 셀 펠 릿 resuspend와 모자 거르는 FACS tubeand 통해 필터 FACS-분리 ( 그림 1B)로 세포 인구에. 다 색 FACS 프로토콜을 수행 하기 전에 각 사람의 각 형광 색소의 가능한 다른 일에 대 한 수정 해야 합니다. 이렇게 하려면 셀 서 스 펜 션와 별도로 각 fluorophore 활용 된 항 체를 품 어 하 고 보상 행렬을 만들기 위해 모든 fluorophores 단색 컨트롤을 통해 모든 감지기에서 스펙트럼 중복 값을 측정 한다.참고:이 실험에서 다소 85 μ m 노즐을 갖춘 고용 되었다. 10 여성 쥐에서 일반적인 준비 약 800000 보장할 LD 셀. FACS 절차 동안 수 풀 형성 하는 경우 보조 여과를 진행 합니다. 기본 유 방 LD 셀의 시드 FACS 절차 동안 코트 콜라겐 멀티 잘 조직 배양 플레이트 나 코팅 솔루션. 37 ° C에서 1 시간, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에서 품 어. 코팅 솔루션을 제거 하 고 세척 매체 #1 도금의 바로 전에 세척. 세척 솔루션 # 1의 10 mL와 FACS 절차에서 복구 하는 세포를 세척 하 고 스핀 5 분에 대 한 400 x g 다운 상쾌한 제거. 유 방 2D 문화 매체 (500 µ L/잘) 및 콜라겐 치료 플레이트에 셀 펠 릿 resuspend 적절 한 셀 첨부를 확산 있도록 48 h에 대 한 셀 문화 인큐베이터에 앉아 셀을 하자.참고:는 일반적인 정렬 10 여성 쥐에서 24-잘 멀티 잘 플레이트의 6-8 우물 최적의 셀 밀도 (100 000 셀/잘)를 얻을 것입니다. YMaSCs (유 방 줄기 세포 유도 하는 YAP)의 유도참고:이 단계 이후부터 모든 절차는 BSL-2 조건 하에서 수행 되어야 합니다. 유 방 식민지 매체를 준비 합니다. 갓 셀 뿌리기 직전 매체에 지하실 멤브레인 매트릭스를 추가 합니다. 혈 청 무료 유 방의 두 개의 볼륨으로 한 양의 FUdeltaGW rtTA 바이러스 상쾌한, FUW-tetO-얍 (TAZ) 상쾌한의 하나의 볼륨을 혼합 하 여 transduce 기본 LD 셀 lentiviral 감염으로 유도 하는 YAP 유 방 줄기 세포 (yMaSCs)의 유도 대 한 보충, 500 mL의 총 볼륨에서의 2D 문화 매체 2 배 농도 48 h lentiviral supernatants 셀을 품 어. 전형적인 lentiviral 준비 온라인 프로토콜22를 참조 하십시오. 감염 후 부착 세포를 세척 하 고 2 µ g/mL doxycycline exogenous 얍 (TAZ) 유전자 발현을 유도 하는 것으로 보충 하는 유 방 2D 문화 매체와 치료. 셀 비어, EGFP 또는 YAPS94A 표현 벡터, 또는 유도할 수 있는 야프 (TAZ) 벡터, 감염 세포에 감염을 사용 하지만 부정적인 컨트롤로 doxycycline 없이 왼쪽.참고: 성공적인 감염 수 확인 qRT-PCR transgene 인간 짖 에 대 한 특정 한 뇌관으로 하 여 앞에서 설명한1. 부착 세포 0.05%를 가진 외피 분리 doxycycline와 유도의 7 일 후 트립 신/EDTA (150 μ/잘) 37 ° C에서 10 분 1: 5을 세척 매체 #2 (600 μ/잘)을 diluting 하 여 trypsinization를 중지 하 고 셀. 2 μ g/mL doxycycline와 셀/잘 24-잘 ultralow 첨부 파일 접시에에서 1000의 clonogenic 조밀도에 씨앗 보충 각 잘 (1 mL), 유 방 식민지 중간에 셀 resuspend참고: 유 방 식민지 매체 얼음 차가운 지하실 멤브레인 매트릭스 덧셈의 시간에 있는지 확인 합니다. 지하실 막 매트릭스 해야 합니다 항상 도착 후,-20 ° C에 저장 하 고 하룻밤; 4 ° C에서 천천히 해 동 일단 해 동, 그것 항상 처리 되어야 합니다에 얼음, 제조업체의 지침에 따라. 한 번 짖-LD 셀 표현 확산 시작 및 정지 (yMaSC 식민지) MaSC-같은 식민지로 시드 후 (14 일), 계산 성장과 처리 추가 분석 (그림 1C).참고: (1.4.3 포인트)로 부정적인 제어 셀은 단일 셀으로 유지 됩니다. YMaSC 식민지 성장;의 14 일 동안 신선한 유 방 식민지 매체 마다 72 h와 문화를 보충 이렇게 하려면 5% 지하실 멤브레인 매트릭스, 10 배 농도 보충의 보충 없이 유 방 식민지 매체의 약 수를 준비 하 고 1: 10을 각 영역 (예: 100 μ 총 매체의 1 ml에서), 과도 한 희석을 피하기 위해 전체 볼륨 추가 매트릭스 현 탁 액입니다. 하위 yMaSCs의 배양 유 방 식민지 매체에서 기본 식민지를 복구 후 해리와 초기값을 다시 설정 합니다.참고: yMaSC 식민지 얍 재설정 LD 셀에서 파생 된 자체 갱신 용량을 확보 하 고 성공적으로 하위 추가 doxycycline 관리 (즉, 유전자 변형 얍/TAZ의 표현 별도로) 없이 경작 될 수 있다. 준비, 셀 문화 후드 단계 1.4.1 에서처럼 유 방 식민지 매체 및 유 방 organoid 매체. 각 샘플을 수집 하 고 얼음의 초과 볼륨 (10:1)에서 품 어 차가운 HBSS 지하실 멤브레인 매트릭스를 solubilize 위해 얼음에 1 h. 씻어 식민지 3 x 180 x g 5 분 및 얼음에 resuspend에서 centrifuging으로 차가운 HBSS. 0.05 %trypsin / EDTA 단일 세포 현 탁 액을 37 ° C에서 10 분 동안에 식민지를 품 어. 단일 세포 수준으로 완벽 한 분리 되도록 p1000 팁 10 배 아래로 식민지 플라스틱 셀/잘 24-잘 ultralow 첨부 파일 접시에에서 1000의 clonogenic 조밀도에 doxycycline 없이 유 방 식민지 매체 (1 mL 각 잘) 수와 다시 셀. 10-14 일 마다 자체-갱신 평가 절차를 뿌리고이 반복 합니다. 세 번째 통과 하기 전에 yMaSC 식민지 organoid 문화 조건, yMaSC 확장을 강화 하 고 미니-땀 샘, vivo에서 유 방 동맥의 밀접 하 게 연상 bilayered 상피에 조직 자체의 형성을 위한 통로 조직학 조직입니다. 1.5.3 1.5.4 단계에서 유 방 식민지 매체에서 식민지를 복구 합니다. 100% 성장 인자에서 resuspend 식민지 지하실 멤브레인 매트릭스, 매트릭스의 150 µ L에서 24-잘 ultralow 정판의 각 음에 대 한 20-25 식민지의 최대 replate 고려 감소. 37 ° C에서 40 분 셀 문화 인큐베이터에 접시를 품 어 그리고 지하실 멤브레인 매트릭스 고형화 하 고 유 방 organoid 매체의 500 μ와 젤을 오버레이. 몇 일 후에 organoids (그림 1E) 신진 형태로 식민지의 형성에 대 한 확인 합니다. 후에 10-14 일, 통로 또는 프로세스 추가 분석을 위해 organoids. Organoids 문화 통로, 각 샘플을 수집 하 고 얼음의 초과 볼륨 (10:1)에서 배양 하 여 organoids를 복구 차가운 HBSS 지하실 멤브레인 매트릭스를 solubilize 위해 얼음에 1 h. Organoids 3 세척 스핀에 의해 x 180 x g 5 분에서 아래로 하 고 얼음에 resuspend 감기 HBSS. 0.05 %trypsin / EDTA 단일 세포 현 탁 액을 37 ° C에서 10 분 동안에 organoids를 품 어. 단일 세포 수준으로 완벽 한 분리 되도록 p1000 팁 10 배 아래로 organoids 플라스틱 100% 증가율 감소 지하실 멤브레인 매트릭스 (24-잘 ultralow 정판의 각 잘 150 μ)의 한 방울에 단일 셀 서 스 펜 션으로 다시 시드하십시오. 지하실 막 매트릭스 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 40 분을 배양 하 여 젤을 형성 하 고 유 방 organoid 매체의 500 μ와 젤 오버레이 하자.참고: yMaSC organoids 단계 1.5.13, trypsinization를 피하에서 100% 지하실 멤브레인 매트릭스 문화에서 복구 하 여 cryopreserved 수 있습니다. 10 %DMSO 보충 유 organoid 매체에 저장 합니다. 신속 하 게 동결-80 ° C에서 yMaSC organoids와 다음 액체 질소에 보존. 2입니다. yDucts 세대 참고: 모든 미디어와 솔루션 구성 섹션 2는 표 2에 지정 됩니다. 주 췌 acini의 절연 70% 해 부 집게와가 위 배치 EtOH 셀 문화 후드 포상 문화 매체, 각 마우스;에 대 한 15 mL에서 준비 포상 복구 매체, 각 마우스; 60 mL PBS/PS; 재고 솔루션 콜라 나; 콜라 나 솔루션, 각 마우스;에 대 한 15 mL 쥐 꼬리 콜라겐 무력화 나 솔루션. 쥐 꼬리 콜라겐 중화 나 pH = 7, 어 얼음에 모든 시 약을 그것을 중화 쥐 꼬리 콜라겐 PBS/ps. 계속에 있는 교원 질 용 해, 그리고 10N HCl. Dilute 2.5 mg/ml와 아세트산 버퍼링을 0.1 N NaOH와 함께 먼저 조정 하 여. 6 적절 한 유전자 형의 9 주 된 쥐를 희생. 그것의 뒤에 각 마우스를 놓고 70% 에탄올 솔루션으로 복 부를 세척 합니다. 복 부 벽을 따라 절 개를 경도 확인 합니다. 및 (사용 하 여 비장 가이드로) 췌 장 해 부 찾아서 10 mL 얼음에 10 cm 비 세포 접착 요리에 차가운 PBS/ps. 전송 셀 문화 후드 즉시 요리. 이 단계 이후, 셀 문화 후드 항상 작동 합니다. 새로운 비-셀에 각 췌 전송 접착제 접시 이전 가득 콜라의 7 mL 나 솔루션 1. 신속 하 게 약 1 m m3 파편의 균질 조직 정지를 일회용 scalpels의 한 쌍 각 췌를 말하다.참고:이 절차 최적의 세포 생존 능력에 대 한 더 이상 2 분 걸릴 한다 중요 하다. 37 ° C에서 콜라 소화, 5% CO2 10 분, 균질 성 조직 소화를 보장 하기 위해서 모든 3 분 떨고 셀 문화 인큐베이터에 접시를 품 어. 50 mL 원뿔 튜브 (각 췌 하나) 소화 조직 복구, 포상 세척 매체의 10 mL와 접시 세척 같은 50 mL 원뿔 튜브에, 이상의 3 배 아래로 조직 소화 pipetting. 100 x g 18 ° C에서 5 분에 대 한 소화 조직을 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한.참고:이 단계 동안 콜라 활동 낮은 18 ° C에서 셀 아래로 회전 합니다. 조직 resuspend 펠 렛 7 mL 콜라에에서 나 솔루션 및 새로운 10 cm 비 세포 접착 접시에이 솔루션을 부 어. 콜라 소화 단계 2.1.5, 떨고 동종 조직을 소화를 보장 하기 위해서 모든 3 분에서 10 분 동안 37 ° C에서의 두 번째 라운드에 대 한 요리를 품 어. 한편, 100 μ 셀 스 트레이너로 각 췌 한 깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브 준비. 소화 조직을 복구 하 고 macerating 살 균 10 mL 주사기 플런저 (전단 힘 여과기 표면에 접선을 피하 조직, 신중 하 게 눌러 있는지 확인)를 조직 하 여 100 μ 셀 스 트레이너를 통해 전달 합니다. 포상 세척 매체의 10 mL와 함께 접시를 세척 하 고 동일한 100 μ 셀 스 트레이너가 10ml를 통과. 100 x g 18 ° C에서 5 분에 대 한 소화 조직을 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한. 포상 세척 매체의 10 mL와 함께 조직 펠 릿을 복구 합니다. 이미 포함 된 신선한 포상 세척 매체의 추가 10 mL, 물의 resuspension의 펠 릿에 대 한 과도 한 pipetting 피하고 50 mL 원뿔 튜브에 셀 솔루션을 전송 합니다. 100 x g 18 ° C에서 5 분에 대 한 소화 조직을 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한. 조심 스럽게 소화 조직 포상 복구 매체의 6 ml에서 resuspend 하 고 6-잘 멀티 잘 조직 문화 접시, 3 mL의 2 우물에 그것을 배포. stereomicroscope에서 신중 하 게 평가 포상 격리의 품질 단일 셀 ( 그림 2B참조);의 작은 비율과 포상 클러스터의 동종 중단으로 나타나는 어떤 큰 조직을 제거 덩어리 결국 제시 (일반적으로 육안으로도 보이는), 솔루션에서 pipetting으로. 주 췌 acini의 시드 셀 복구 수 있도록 2 h, 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 소화 포상 클러스터를 품 어. 셀 복구 코트 동안 48-잘 멀티 무력화 쥐 꼬리 콜라겐의 100 μ와 웰 스 하 고 양식에 히드로 쿠션 수 있도록 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간에 품 어. 후 세포 복구, 2 h 포상 세포 현 탁 액 원뿔 튜브에 수집, 18 ° C에서 100 x g에 5 분 동안 스핀 다운 하 고는 상쾌한을 제거 합니다. 포상 문화 매체 (150 μ 48 잘 조직 배양 플레이트의 각 음에 대 한)의 적절 한 볼륨에는 acini resuspend. 각 씨는 최적의 밀도 (100-120 포상 클러스터/잘)를 16 우물에 췌 장을 해리 했다. 희석 중화 쥐 꼬리 콜라겐의 동등한 양으로이 포상 일시 중지 나 솔루션, 얼음에 튜브를 유지. 신중 하 게 혼합 하 고 신속 하 게 씨앗 2.2.2 (300 μ 48 잘 멀티 잘 조직 배양 플레이트의 각 음에 대 한)에 설명 된 콜라겐 쿠션 위에 세포 현 탁 액. 양식에 히드로 있도록 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간을 품 어. 췌 장 organoids의 유도 500 μ의 포상 문화 매체 R26-rtTAM2;에서 췌 장 organoids의 야프-종속 유도 2 μ g/ml doxycycline 보충으로 콜라겐 hydrogels 오버레이 TetO 얍S127A 쥐; 네거티브 컨트롤 wt 셀 교양된 같은 조건 또는 R26-rtTAM2;에 의해 제공 됩니다. TetO 얍S127A doxycycline의 부재에서 경작 하는 세포. 문화 포상 세포 포상 문화 매체에서 2 μ g/mL doxycycline 상쾌한 문화 매체 (300 μ/잘) 모든 48 h organoid 형성 ductal 같은 구조 ( 를 형성 하는 낭종으로 형태학 적 변화에 의해 다음 5 ~ 7 일에 대 한 보충 그림 2C). 세포를 췌 장 organoid 문화 조건에 passaged 또는 추가 분석에 대 한 수확 수 있습니다 organoids 형성 되 면 (예: RNA 추출, 면역 형광 검사). 하위 췌 장 organoids의 배양 그들의 자기 재생 능력을 평가, clonally 유도 하는 YAP 췌 장 organoids (yDucts) 외 인 얍/TAZ 공급 (즉별도로 3 차원 지하실 멤브레인 매트릭스 hydrogels (췌 장 organoid 문화 조건)에 통행. doxycycline 관리는 별도로). 트립 신 준비 0,05%/EDTA; 100% 증가율 감소 지하실 멤브레인 매트릭스; 췌 장 Organoid 매체와 콜라 나 솔루션 b. 준비 15 mL 원뿔 튜브 콜라의 4 mL 나 솔루션 B passaged 수를 각 잘. 문화 매체를 버리고, 신중 하 게 부드러운 포부에 의해 hydrogels 우물에서 추출 하 고 원뿔 튜브에 그들을 전송. 콜라겐 매트릭스 (체크는 히드로 solubilized 완전히 때까지 각 10 분)의 완벽 한 소화 수 있도록 지속적인 활기찬 동요와 함께 30 분 동안 37 ° C에서 튜브를 품 어. 750 x g 2 분에 복구 된 셀 아래로 회전 시키십시오 고 상쾌한을 제거 합니다. 품 어 트립 신 1 mL에 복구 된 셀 단일 세포 현 탁 액을 37 ° C에서 10 분 동안 0,05%/EDTA. 9 mL PBS 1의와 트립 신을 희석 x 750 x g 2 분 동안에 아래로 회전 하 고 상쾌한 제거. 얼음 차가운 증가율 감소 지하실 멤브레인 매트릭스에서 셀 펠 릿과 매우 낮은 부착 판 (일반적으로 24-잘 접시의 한 잘에서 150 μ의 드롭)에 씨앗을 resuspend. 37 ° C에서 40 분 셀 문화 인큐베이터에 접시를 배양 하 여 고형화 하 고 췌 장 Organoid 매체와 다음 오버레이 지하실 멤브레인 매트릭스 히드로 게 (500 μ 각 잘). yDucts는 7-10 일 (그림 2D) 낭종 같은 organoids로 성장할 것입니다. 더 organoids를 뿌리고 제거할 수 있습니다 지하실 멤브레인 매트릭스에서 얼음 차가운 PBS 1 부 화에 대 한 x 30 분 뒤 세척 하 여 3 번 스핀 다운 5 분 및 얼음 차가운 PBS 1 물의 resuspension 180 x g에서 매트릭스 carryover 피하기 위해 x. Organoids는 다음 단일 셀 정지를 10 분에 대 한 트립 신 0.05% 해리 신선한 지하실 멤브레인 매트릭스에 다시 시드해야 고 췌 Organoid 매체 (2.4.7-2.4.8)로 입혔다. yDuct organoids 단계, 2.4.9 trypsinization, 피하로 100% 지하실 멤브레인 매트릭스 문화에서 복구 하 여 액체 질소에 cryopreserved 수 고 10 %DMSO 보충 췌 Organoid 매체에 저장. yDuct organoids-80 ° C에서 신속 하 게 고정 되며 다음 액체 질소에 보존.