De Novo Поколение соматических стволовых клеток, YAP/TAZ

Все животные процедуры выполнялись придерживаясь наших институциональных руководящих принципов и одобренные OPBA и Министерство здравоохранения 1. поколение яп индуцированной молочной как стволовые клетки (yMaSCs) Примечание: Все средства массовой информации и решение композиции для раздела 1 указываются в таблице 1. Изоляция первичного молочной клеточных популяций Подготовка под капотом культуры клеток: одноразовые скальпели, гиалуронидаза решения, диссоциация средний, Гемолитический решения, сортировки решения, коллагена, покрытие решение, Ca2 + хелатирующий решение, мыть среднего #1, мыть средних #2, dispase решение, молочной железы 2D питательной среды, лед холодной HBSS/ПС. Для типичной эксперимента Пожертвуйте 10 самок мышей (либо CD-1 штамм C57BL/6), 8-12 недель, шейки матки дислокации. Стерилизуйте живота с обильным 70% этанола раствор до вскрытия. Вскрыть молочных желез, сделав Y-образный разрез вдоль брюшной кожи и тщательно разделяющей желез из брюшины, осторожно потянув пинцетом Дюмон. Место расчлененных желез в-клеток клей блюдо с 10 мл лед холодной HBSS/PS (20 желез для каждого блюдо), убедившись, что не выполнять над любой фрагмент кожи. Под капотом культуры ткани стирать каждый железы один раз в 10 мл свежего HBSS/PS и поместите их в пустой клей блюдо-клеток (20 желез для каждого блюдо). Не используйте культуры ткани пластины, как клетки будут склонны придерживаться их вызывая значительные потери материала. Мелко фарш молочных желез с скальпелей до получения однородной смеси 1 мм3 фрагментов. Восстановить фарш ткани от каждого блюдо в 10 мл среды диссоциации с 25 мл Серологические Пипетки чтобы избежать засорения и передачи подвеска в 50 мл Конические трубки дозирование по крайней мере 5 x дезагрегировать ткани сгустки.Примечание: Для эффективного переваривания, надлежащего мясорубки ткани в шаге 1.1.5 имеет решающее значение. Инкубируйте 1 час при 37 ° C с непрерывной энергичной встряхивания. Через 1 ч проверьте огневки и продлить инкубации на 10 минут, если сгустки по-прежнему присутствуют. Спин вниз переваривается ткани на 400 g x 5 мин при комнатной температуре и удалить супернатант. Ресуспензируйте Пелле ткани в 3 мл гемолитический раствора и Инкубируйте 3 мин на льду.Примечание: Гемолиз настолько довольно жестокое обращение, строгие сроки имеет решающее значение на этом этапе. Вымыть клетки с 10 мл мыть среды #1, спина вниз переваривается ткани на 400 x g 5 минут и удалить супернатант. Ресуспензируйте Пелле ткани в 10 мл мыть средних # 2 и пластины в 10 см культуры ткани блюда. Инкубируйте блюда за 1 ч при 37 ° C в инкубатор культуры клеток.Примечание: Этот шаг позволит удаления большинства фибробластов, которых должны придерживаться культуры блюдо. Восстановить суспензию клеток из блюд и вылить в 50 мл Конические трубки. Спина на 400 g x 5 мин и ликвидации супернатант. Помыть лепешка дважды в 10 мл Ca2 + Хелатирующие решение на спиннинг вниз на 400 x g 5 минут каждый раз. Ресуспензируйте гранулы в 5 мл 0,25% трипсина/ЭДТА и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C. Добавьте 5 мл dispase раствора на вершине раствор трипсина и дополнить с DNase 1μg/мл. Пипетка вверх и вниз по крайней мере 5 x через 1 мл наконечник дезагрегировать ДНК пряди и инкубировать в течение 10 минут при 37 ° C, пожимая каждые 3 мин. Добавьте 10 мл мыть среды #2 и фильтр в новой 50 мл Конические трубки через стрейнер клеток 40 мкм. Спин вниз суспензию клеток на 400 g x 5 мин и отбросить супернатанта, убедившись в том устранить все жидкости. Очистка молочной эпителиальных клеток, СУИМ Подготовьте смесь антител, добавив 10 мкл Лин (антитела мыши линии коктейль), 12 мкл анти CD326 (Ep-CAM), до конечной концентрации 30 нг/мл, 10 мкл анти CD49f, до конечной концентрации 25 нг/мл, 10 мкл анти CD61, до конечной концентрации 10 нг/мл , 2,5 мкл анти CD29, до конечной концентрации 2,5 нг/мл.Примечание: от этого шага к шагу 1.3, всегда работают в темноте, чтобы избежать отбеливания дневно обозначенные антител. Для каждой гранулы: Храните небольшое количество клеток (погружением кончик 100 мкл в гранулах) в отдельном трубку. Ресуспензируйте клетки в 500 мкл сортировки решение в трубке СУИМ и держать на льду как немеченого образца для СУИМ процедуры. Ресуспензируйте каждой гранулы в 200 мкл мыть среды #1, добавить 44.5 мкл антител смеси, Пипетка тщательно и Инкубируйте 30 мин на льду в темноте. Разбавления суспензии клеток в 10 мл мыть среды #1, спина вниз на 400 g x 5 минут и удалить супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл раствора сортировки и фильтра через Кап ситечко СУИМ tubeand приступить к FACS-сепарации клеточных популяций (как показано на рисунке 1B). Перед выполнением протокола многоцветной СУИМ, убедитесь, что правильно для возможного распространения каждого флюрохром в каждой из других. Чтобы сделать это, инкубировать каждое антитело проспряганное Флюорофор отдельно с суспензию клеток и измерения спектрального наложения значения для всех флуорофоров и всех детекторов, через элементов одного цвета, чтобы создать матрицу компенсации.Примечание: В этом эксперименте использовалась сортировщик с 85 мкм сопла. Типичная подготовки от 10 самок мышей даст около 800000 LD клетки. Перейти к вторичной фильтрации, если сгустки форме в ходе процедуры СУИМ. Заполнение первичных клеток молочной железы LD Во время процедуры СУИМ пальто multi хорошо культуры ткани пластины с коллагеном я покрытие решения. Инкубируйте 1 час при 37 ° C, 5% CO2 в инкубатор культуры клеток. Удалите покрытие решение и промойте среднего #1 мыть перед обшивкой. Вымыть клетки, оправился от СУИМ процедуры с 10 мл промывочного раствора #1, спина вниз 400 g x 5 мин и ликвидации супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток молочной 2D питательной среды (500 мкл/а) и коллаген лечение пластины. Пусть сидеть в инкубатор культуры клеток в течение 48 часов для обеспечения надлежащего клеток вложений и распространения клеток.Примечание: Для типичного сортировки от 10 самок мышей, 6-8 скважин 24-ну multi хорошо плиты даст плотность оптимальный клеток (100 000 клеток/хорошо). Индукция yMaSCs (яп индуцированной молочной стволовые клетки)Примечание: От этого шага все процедуры должны выполняться в условиях BSL-2. Подготовка среднего молочной колонии. Свеже добавьте матрицу базальной мембраны в среду незадолго до заполнения ячейки. Для индукции яп индуцированной молочной стволовых клеток (yMaSCs) передают первичных клеток LD лентивирусные инфекции путем смешивания один объем FUdeltaGW-rtTA вирусных супернатанта, один объем супернатант FUW-Тето Яп (или таз), два тома из молочной сыворотки бесплатно 2D культуры среднего 2 x концентрации добавки, в общем объеме 500 мл. Инкубируйте клетки с лентивирусные supernatants за 48 ч. Для типичной лентивирусные подготовки пожалуйста, обратитесь к онлайн протокол22. После заражения мыть адэрентных клеток и лечения с молочной 2D питательной среды, дополнена 2 мкг/мл доксициклин побудить экзогенных экспрессии генов YAP (или таз). Используйте клетки, зараженные с пустым, EGFP или YAPS94A выражая вектора или клетки, инфицированные индуцибельной YAP (или таз) векторов, но уехала без доксициклин как негативный контроль.Примечание: Успешное инфекции может быть проверен qRT ПЦР с праймерами специфическими для человека YAP трансген, как описано выше1. После 7 дней индукции с доксициклин, отсоединить адэрентных клеток, инкубация с 0,05% трипсина/ЭДТА (150 мкл/ну) 10 минут при 37 ° C; остановить trypsinization путем разбавления 1:5 в среде мыть #2 (600 мкл/а) и подсчитать ячейки. Ресуспензируйте клеток в среде молочной колонии (1 мл раствора для каждой скважины), дополнены 2 мкг/мл доксициклин и семян на колониеобразования плотности 1000 клеток/хорошо в 24-ну сверхнизких крепежные пластины.Примечание: Убедитесь, что средство молочной колонии ледяной в то время сложения матриц базальной мембраны. Матрица базальной мембраны должны всегда храниться в-20 ° C по прибытии и талой медленно при температуре 4 ° C на ночь; После размораживания, он должен всегда осуществляться на льду, согласно рекомендациям производителя. Однажды YAP-выражая LD клетки начать пролиферирующих и расти как MaSC как колоний в суспензии (yMaSC колоний) (14 дней после посева), рассчитывать и обрабатывать для дальнейшего анализа (рис. 1 c).Примечание: Отрицательный контроль клетки (как в пункте 1.4.3) будет оставаться как отдельные клетки. Пополнять культуры с свежей молочной колонии среднего каждые 72 ч в течение 14 дней yMaSC колонии роста; для этого подготовить Алиготе молочной колонии среды без матрицы 5% базальной мембраны, дополнена 10 x концентрации добавок и добавить 1:10 от общего объема для каждой скважины (например 100 мкл в 1 мл общей среды), чтобы избежать чрезмерного разбавления Матрица подвеска. Югу культивирования yMaSCs Восстановить основной колоний от среднего молочной колонии, затем отделить и повторное заполнение.Примечание: yMaSC колонии, производный от яп перепрограммирование LD клетки приобретают самообновлению потенциала и может быть успешно югу культивировали, без дальнейшего доксициклин администрации (т.е. независимо от выражения трансгенных YAP/таз). Подготовьте, под капотом культуры клеток, молочной колонии среднего как шаг 1.4.1 и молочной органоид среднего. Собирать каждый образец и инкубировать в избыточного количества льда (10:1) и холодной HBSS за 1 час на льду, для того чтобы солюбилизировать последнего матрице базальной мембраны. Вымойте колоний 3 x центрифугированием на 180 g x 5 мин и Ресуспензируйте в лед холодной HBSS. Инкубируйте колоний в 0,05% трипсина/ЭДТА 10 минут при 37 ° C для получения одной ячейки подвеска. Пипетка колонии вверх и вниз 10 x с наконечником p1000 для обеспечения полной диссоциации одной ячейки уровня. Граф и повторное заполнение клеток в среде молочной колонии (1 мл раствора для каждой скважины) без доксициклин на колониеобразования плотности 1000 клеток/хорошо в 24-ну сверхнизких крепежные пластины. Повторите это, пассированый процедура каждые 10-14 дней, чтобы оценить самообновления. До третьего проход проезд yMaSC колонии в условиях культуры органоид, для повышения yMaSC расширения и возможность для формирования мини желез, которые самостоятельно организовать в bilayered эпителия, тесно напоминает в vivo молочной железы Гистологические Организации. Восстановление колоний от среднего молочной колонии как шаг 1.5.3 в 1.5.4. Ресуспензируйте колоний в фактор роста 100% Снижение базальной мембраны матрицы, учитывая replate максимум 20-25 колоний для каждой скважины 24-ну сверхнизких крепежную пластину в 150 мкл матрицы. Инкубировать пластины в инкубатор культуры клеток на 40 минут при 37 ° C и пусть базальной мембраны матрица затвердеть и затем наложить гели с 500 мкл молочной органоид среды. После нескольких дней проверить для формирования колоний к форме многообещающий organoids (Рисунок 1E). После 10-14 дней, проход или процесс organoids для дальнейшего анализа. Для прохода organoids культур, восстановить organoids, собирая каждый образец и инкубации избыточного объема (10:1) льда холодной HBSS за 1 час на льду, для того чтобы солюбилизировать последнего матрице базальной мембраны. Вымойте organoids 3 x, спин вниз на 180 g x 5 мин и Ресуспензируйте в лед холодной HBSS. Инкубируйте organoids в 0,05% трипсина/ЭДТА 10 минут при 37 ° C для получения одной ячейки подвеска. Пипетка organoids вверх и вниз 10 x с наконечником p1000 для обеспечения полной диссоциации одной ячейки уровня. Повторное заполнение одну ячейку суспензий в каплю фактор роста 100% Снижение базальной мембраны матрицы (150 мкл для каждой скважины 24-ну сверхнизких крепежную пластину). Пусть матрице базальной мембраны образуют гель по инкубации 40 мин при 37 ° C в инкубатор культуры клеток и наложение гели с 500 мкл молочной органоид среды.Примечание: yMaSC organoids может быть криоконсервированных путем восстановления из 100% базальной мембраны матрица культуры как шаг 1.5.13, избегая trypsinization. Хранить в среде молочной органоид, дополнена 10% ДМСО. Быстро замораживания organoids yMaSC-80 ° c и затем сохранены в жидком азоте. 2. поколение yDucts Примечание: Все средства массовой информации и решение композиции для раздела 2, указаны в таблице 2. Изоляция первичного ацинусов поджелудочной железы Место вскрытия щипцы и ножницы в 70% EtOH и подготовить под клетки культуры капот ацинарной питательной среды, 15 мл для каждой мыши; железистый восстановления среды, 60 мл для каждой мыши; PBS/PS; Стоковый раствор коллагеназы я; коллагеназы я раствор А, 15 мл для каждой мыши; нейтрализовать крысы хвост коллаген я решение. Нейтрализовать крысы хвост коллаген I к рН = 7, регулируя сначала с 0,1 Н NaOH в буфер уксусной кислоты, в которой растворяется коллагена, а затем с 10N HCl. развести до 2,5 мг/мл в PBS/PS. держать коллаген хвост крысы, я и все реагенты на льду, чтобы нейтрализовать его. Пожертвуйте 6-9 недель old мышей надлежащего генотипа. Поместите каждую мышь на его обратно и мыть живот с 70% этанола раствор. Сделайте продольный разрез вдоль брюшной стенки. Найдите и вскрыть поджелудочной железы (с помощью Хандра как руководство) и поместите его в 10 см-клеточной клей блюдо в 10 мл лед холодной PBS/PS. передачи блюда сразу под капотом культуры клеток. От этого шага работа всегда под капотом культуры клеток. Перевод каждого поджелудочной железы в новую ячейку клей блюдо, ранее заполнены с 7 мл коллагеназы я решение а. Быстро фарш каждый поджелудочной железы с парой одноразовые скальпели, для получения однородной ткань подвеска примерно 1 мм3 фрагментов.Примечание: Важно отметить, что эта процедура должен занять не более 2 мин для жизнеспособности клеток оптимального. Инкубируйте блюдо для коллагеназы пищеварение при 37 ° C, 5% CO2 в инкубатор культуры клеток за 10 мин, пожимая каждые 3 мин для обеспечения однородной ткани пищеварение. Восстановить переваривается ткани в 50 мл Конические трубки (один для каждого поджелудочной железы), мыть блюдо с 10 мл ацинарной мыть среды и поместите его в же 50 мл Конические трубки, закупорить переваривается ткани вверх и вниз, не более, чем 3 x. Спин вниз переваривается ткани на 5 минут при 100 x g при 18 ° C и удалить супернатант.Примечание: Спин вниз клетки на 18 ° C до снижения активности коллагеназы во время этого шага. Ресуспензируйте ткани пеллет в 7 мл коллагеназы решение A и вылить это решение в новое блюдо клей-клеток 10 см. Инкубируйте блюдо для второго раунда коллагеназы пищеварения при 37 ° C 10 мин как шаг 2.1.5, пожимая каждые 3 мин для обеспечения однородной ткани пищеварение. В то же время готовить один чистый 50 мл Конические трубки для каждого поджелудочной железы, увенчанный стрейнер ячейки 100 мкм. Восстановить переваривается ткани и проходят через сито ячейки 100 мкм, размягчения тканей с поршень шприца стерильные 10 мл (не забудьте тщательно прижмите ткани, избегая сдвига касательной к поверхности фильтра). Вымойте блюдо с 10 мл среды ацинарной мыть и пройти этот 10 мл через ячейки 100 мкм же сетчатый фильтр. Спин вниз переваривается ткани на 5 минут при 100 x g при 18 ° C и удалить супернатант. Восстановите ткани лепешка с 10 мл среды ацинарной мыть. Передача решения клеток в 50 мл Конические трубки, уже содержащий дополнительные 10 мл свежего ацинарной мыть среды, избегая чрезмерного закупорить ресуспендирования гранул. Спин вниз переваривается ткани на 5 минут при 100 x g при 18 ° C и удалить супернатант. Тщательно Ресуспензируйте переваривается ткани в 6 мл ацинарной восстановления среды и распространять его в 2 скважин 6-ну multi хорошо культуры ткани пластины, 3 мл. Под стереомикроскопом тщательно оценить качество ацинарной изоляции, которые появляются как однородная суспензия ацинарной кластеров, с незначительных долей единичных клеток (см. Рисунок 2B); Удалите любой большой ткани сгустки в конечном итоге настоящее время (обычно видна также невооруженным глазом), закупорить их из раствора. Заполнение основной ацинусов поджелудочной железы Инкубируйте переваривается ацинарной кластеров при 37 ° C в инкубатор культуры клеток для 2 h, чтобы позволить для восстановления клеток. Во время восстановления слой клеток 48-ну multi скважины с 100 мкл нейтрализованы крысы хвост коллагена я и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C в инкубатор культуры клеток разрешить гидрогеля подушку в форме. После того, как 2 h восстановления клеток, собирать железистый клетки подвеска в коническую пробирку, уменьшается на 5 минут при 100 x g при 18 ° C и удалить супернатант. Ресуспензируйте Ацинусы в соответствующий объем ацинарной питательной среды (150 мкл для каждой скважины плиты 48 хорошо культуры тканей). Семя каждый отделить поджелудочной железы в 16 скважин для получения оптимальной плотности (100-120 ацинарной кластеры/хорошо). Разбавляют этот ацинарной подвеска с равным объемом нейтрализованы крысы хвост коллагена я решения, сохраняя трубы на льду. Тщательно перемешать и быстро семян суспензию клеток поверх подушки коллагена, описанные в 2.2.2 (300 мкл для каждой скважины 48 хорошо multi хорошо культуры ткани пластины). Инкубируйте 1 час при 37 ° C в инкубатор культуры клеток разрешить гидрогеля на форме. Индукция поджелудочной железы organoids Наложение гидрогели коллаген с 500 мкл из ацинарной питательной среды с 2 мкг/мл доксициклин для индукции яп зависимые поджелудочной железы organoids от R26-rtTAM2; Тето-япS127A мышей; негативный контроль обеспечиваются wt клетки культивировали в том же условия или R26-rtTAM2; Тето-япS127A клетки культивировали в отсутствие доксициклин. Железистый клетки культуры в железистый Культура средних дополнена 2 мкг/мл доксициклин для 5-7 дней освежающий питательной среды (300 мкл/хорошо) каждые 48 ч и после формирования органоид морфологические изменения в направлении кисты, образуя протоковой как структуры ( Рисунок 2 c). После того, как образуются organoids, клетки могут быть пассированной в условиях культуры поджелудочной железы органоид или собирают для дальнейшего анализа (например: извлечение RNA, иммунофлюоресценции). Югу культивирование поджелудочной железы organoids Для оценки их способности самообновления, клонально проход яп индуцированной поджелудочной железы organoids (yDucts) в трехмерной базальной мембраны матрица гидрогели (поджелудочной органоид культуры условия) независимо от внешних поставок YAP/таз (т.е. независимо от администрации Доксициклин). Подготовить трипсина 0,05%/EDTA; фактор роста 100% Снижение базальной мембраны матрица; Поджелудочной железы органоид среднего и коллагеназы я раствор б. Подготовка 15 мл Конические трубки с 4 мл коллагеназы решение B для каждой скважины быть пассированной. Отказаться от питательной среды, тщательно извлекать гидрогели из скважин нежный стремлением и передавать их на конические трубы. Инкубируйте трубы при 37 ° C за 30 минут, с непрерывной энергичной пожимая разрешить полное переваривание коллагеновой матрицы (проверить каждые 10 мин до тех пор, пока гидрогеля полностью солюбилизирован). Спин вниз восстановленные клетки на 750 g x 2 мин и удалить супернатант. Инкубировать восстановленные клеток в 1 мл трипсина 0,05%/EDTA течение 10 минут при 37 ° C для получения одной ячейки подвеска. Разбавить трипсина с 9 мл PBS 1 x, спина вниз на 750 g x 2 мин и удалить супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток в лед холодной фактор роста снижение базальной мембраны матрицы и семян в ультра-низким крепежные пластины (обычно капля 150 мкл в одной скважине 24-ну плиты). Пусть базальной мембраны матрица гидрогеля затвердевают при инкубации пластины в инкубатор культуры клеток 40 мин при 37 ° C и затем оверлея с поджелудочной железы органоид среднего (500 мкл для каждой скважины). yDucts будет расти как organoids киста как в 7-10 дней (Рисунок 2D). Для дальнейшего пассированый organoids может быть удален из базальной мембраны матрицы по инкубации в лед холодной PBS 1 x 30 мин, затем промывкой 3 раза спин вниз на 180 g x 5 мин и ресуспендирования в лед холодной PBS 1 x, чтобы избежать матрицы уноса. Organoids затем отделить с трипсином 0,05% за 10 мин до получения единичных клеток подвеска и заполнения в матрице свежие базальной мембраны и затем обложил с поджелудочной железы органоид среднего (как 2.4.7-2.4.8). yDuct organoids можно замораживают в жидком азоте путем восстановления из 100% базальной мембраны матрица культуры как шаг 2.4.9, избегая trypsinization, и хранение в поджелудочной органоид среднего дополнена 10% ДМСО. yDuct organoids быстро замороженные при температуре-80 ° и затем сохранены в жидком азоте.