Hier beschrijven we een methode voor de vaststelling van een model voor Zika virus-geïnduceerde microcefalie in muis. Dit protocol bevat methoden voor embryonale, Neonatale en volwassene-fase intracerebrale inoculatie van de Zika-virus.
Het Zika-virus (ZIKV) is een flavivirus momenteel endemisch in Noord-, Midden- en Zuid-Amerika. Nu blijkt dat de ZIKV microcefalie en extra hersenen afwijkingen kan veroorzaken. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de pathogenese van ZIKV in de ontwikkelende hersenen blijft echter onduidelijk. Intracerebrale chirurgische methoden worden vaak gebruikt in het onderzoek neurowetenschap om vragen te stellen over zowel normale en abnormale hersenontwikkeling en hersenfunctie. Dit protocol maakt gebruik van klassieke chirurgische technieken en beschrijving van de methoden waarmee een model ZIKV-geassocieerde neurologische ziekten bij de mens in het zenuwstelsel van de muis. Terwijl directe hersenen inoculatie doet niet model op de normale wijze van transmissie van het virus, kan de methode onderzoekers gerichte vragen betreffende het gevolg na ZIKV infectie van de ontwikkelende hersenen. Dit protocol beschrijft embryonale, Neonatale en volwassen stadia van intraventricular inoculatie van ZIKV. Eenmaal onder de knie, kan deze methode worden een ongecompliceerd en reproduceerbare techniek die duurt slechts een paar uur uit te voeren.
Microcefalie is een voorwaarde die voortvloeien uit de ontwikkeling van de defecte hersenen gekenmerkt door kleiner is dan de gemiddelde hoofdmaat bij pasgeborenen. Kinderen met microcefalie vertonen een aantal symptomen die kunnen bestaan uit vertraging in de ontwikkeling, inbeslagneming, verstandelijke beperking, gehoorverlies, visie problemen en problemen met beweging en balans, ondermeer, afhankelijk van de ernst van de ziekte en 1,2,3te veroorzaken. Deze voorwaarde is multifactoriële aard, met de genetische, besmettelijke agent en milieufactoren gekoppeld aan waardoor microcefalie4,5,6,7,8, 9. 8 kinderen uit 10.000 geboorten werden voor het 2015-2016 ZIKV uitbreken, microcefalie in de Verenigde Staten volgens de CDC10gediagnosticeerd. Op 1 februarist van 2016 de World Health Organization verklaarde de Zika-virus een zorg van de noodsituatie van International van volksgezondheid als gevolg van de alarmerende toename van de microcefalie diagnoses die zijn gekoppeld aan ZIKV besmetting in moeders11, 12. Een recente studie van de CDC op ZIKV gevallen in de Verenigde Staten suggereert dat moeders ZIKV infectie resulteert in een verhoogd risico op 20-fold voor een kind te ontwikkelen microcefalie ten opzichte van niet-geïnfecteerde personen, en 4% van de ZIKV besmet moeders uit de Verenigde Staten hebben geleid tot kinderen met microcefalie11. Het tarief van microcefalie-geassocieerde geboorteafwijkingen tijdens de zwangerschap van ZIKV infectie in Brazilië zijn gemeld te hebben beïnvloed tot 17% van de baby’s in geïnfecteerde moeders, die aangeeft dat andere factoren in Latijns-Amerika kunnen bijdragen aan het verhoogde risico op 13. terwijl we weten dat de ZIKV microcefalie en pathogenese kan veroorzaken in de neurale progenitor cel (NPC) bevolking7,8,14, de volledige pathogenese van ZIKV in de ontwikkeling van de hersenen blijft ongrijpbaar. Het is belangrijk voor de ontwikkeling van diermodellen om de ziekte mechanismen ten grondslag liggen aan de afwijkingen van de hersenen die zijn gekoppeld aan ZIKV infectie verder te onderzoeken.
Direct studeren het effect dat de ZIKV op de ontwikkeling van de hersenen heeft, ontwikkelden we eerst een muismodel intracerebrale inoculatie van embryonale dag 14,5 (E14.5) hersenen met ZIKV7. Deze fase werd gekozen aangezien het als vertegenwoordiger van het einde van het eerste trimester in menselijke dracht14wordt beschouwd. Pups kunnen overleven tot postnatale dag 5 (P5) met deze methode embryonale intracerebrale injectie (~ 1 µL van 1,7 x 106 weefselkweek infectieuze dosis (TCID50/mL)). Deze postnatale pups vertonen een aantal fenotypen ook waargenomen in besmette menselijke baby’s, met inbegrip van uitgebreide ventrikels, neuronale verlies axonale rarefaction, astrogliosis en12,15van de activering van de microglial. Een pasgeboren muis brein is relatief onvolwassen, verwant aan het ontwikkelingsstadium van het menselijk brein op middellange dracht16, en de ontwikkeling van de hersenen van de muis bevat een grote postnatale component. Studeren later dracht fase infecties, is ook een methode voor postnatale infectie beschreven. Pasgeborenen geïnfecteerd met ZIKV bij P1 zijn in staat om te overleven tot aan 13 dagen na injectie. Bloed-geboren volwassen stadium infectie is beschreven in de muis eerder17 maar het gebruik van vereist de interferon (IFN) regulerende factor (IRF) transcriptie factoren IRF-3, -5,-7 triple knockout stam. Dit protocol beschrijft een methode voor het enten van de ZIKV intraventricularly om te omzeilen de antivirale reactie van het lymfkliertest model in de volwassene uit te schakelen. Terwijl dit het lymfkliertest immuunsysteem omzeilt, deze route van injectie doet niet direct na te bootsen de typische route van infectie. Om deze discrepantie direct, kunt de experimentator uitvoeren een uteriene infectie van ZIKV in plaats van de intracraniële route. Overgenomen uit eerdere werk18, hebben we deze techniek in dit protocol embryonale infectie kort beschreven.
De Zika-virusstammen uitgevoerd met deze techniek zijn de Mexicaanse isolaat MEX1-447,19 en de Afrikaanse isoleren heer-766 geïsoleerd in 194720. Zika MEX1-44 werd geïsoleerd in Chiapas, Mexico in januari voor 2016 vanaf een geïnfecteerde Aedes aegypti -mug. Wij verkregen dit virus met toestemming door de Universiteit van Texas Medical Branch in Galveston (UTMB). Daarnaast is het Dengue virus serotype 2 (DENV2) werd geënt met behulp van deze techniek in een vergelijkende studie. DENV2, stam S16803 (reeks GenBank GU289914), werd geïsoleerd uit een patiënt monster uit Thailand in 1974 en gepasseerd in C6/36 cellen. Het virus werd gepasseerd tweemaal in Vero-cellen door de wereld-referentiecentrum voor opkomende virussen en Arboviruses (WRCEVA) voor muis injecties. Dit toont aan dat deze techniek net zo werkt goed voor verschillende stammen van ZIKV en andere flavivirussen die een impact op de ontwikkeling van de hersenen hebben kunnen.
Hier wordt beschreven, is een methode voor intracerebrale inoculatie van de ZIKV in embryonale, Neonatale en volwassen stadia voor het onderzoek van ZIKV-veroorzaakte schade in de ontwikkeling van de hersenen. Terwijl heel simpel: er zijn een paar overwegingen die onderzoekers nemen moeten om ervoor te zorgen de kwaliteit van de studie en de veiligheid van de betrokkenen.
DENV is nauw verwant aan ZIKV in het geslacht flavivirus. DENV heeft geen causaal verband gebracht met pediatrische Hersena…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs wil erkennen Dr. Abdellatif Benraiss bij de Universiteit van Rochester voor zijn mentorschap en de discussies relevant zijn voor het leren van de volwassene chirurgische en neonate technieken. De auteurs wil ook erkennen Dr. James Lauderdale op UGA voor het gebruik van zijn stereotaxic apparatuur en discussies aan het opzetten van de methodologie voor deze techniek, en de vooruitgang voor onderzoek College wetenschappers (ARCS) Stichting voor gerelateerde hun en onze ondersteuning van NIH (NINDS grants R01NS096176-02, R01NS097231-01, en F99NS105187-01).
Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
Modulamp | Schott | – | |
Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | – | |
Mineral Oil | VWR | – | |
micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
Antibodies | |||
Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |