Zika 바이러스 유도 신경 장애 Intracerebral 주입 전략을 사용 하 여 마우스 모델을 수립: 배아, 신생아, 및 성인
Summary
여기는 마우스에서 바이러스 유도 microcephaly Zika의 모델을 설정 하는 방법에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 Zika 바이러스의 미 발달, 신생아, 그리고 성인 무대 intracerebral 접종에 대 한 메서드가 포함 됩니다.
Abstract
Zika 바이러스 (ZIKV) 북쪽, 중앙, 그리고 남아메리카에 현재 발병 flavivirus는 이다. 이제는 ZIKV microcephaly 및 추가 뇌 이상이 발생할 수 있습니다 설치 된다. 그러나, 발전 두뇌에 있는 ZIKV의 병 인을 기본 메커니즘 불분명 남아 있습니다. Intracerebral 수술 방법은 자주 주소 질문 정상과 비정상적인 두뇌 개발 및 뇌 기능에 대 한 신경 과학 연구에 사용 됩니다. 이 프로토콜 클래식 수술 기법을 활용 하 고 마우스 신경 시스템에서 하나의 모델 ZIKV 연관 된 인간의 신경 질환을 허용 하는 방법에 설명 합니다. 직접 뇌 접종 바이러스 전송의 정상 모드를 모델링 하지 않습니다, 하는 동안 메서드를 사용 하면 개발 두뇌의 ZIKV 감염 후 결과 관한 대상 질문을 조사 수 있습니다. 이 프로토콜의 ZIKV intraventricular 접종의 미 발달, 신생아, 및 성인 단계를 설명합니다. 일단 마스터,이 방법만 수행 하는 몇 시간을 소요 하는 간단 하 고 재현성 기술 될 수 있다.
Introduction
Microcephaly 결함이 두뇌 개발 신생아에서 평균 머리 크기 보다 작은 특징에서 유래 하는 조건입니다. Microcephaly 어린이 발달 지연, 발작, 지적 장애, 난청, 시력 문제, 그리고 운동 및 균형, 다른 가운데, 질병의 심각도 따라 문제를 포함할 수 있는 증상의 범위를 전시 하 고 원인1,2,3. 이 상태는 자연, 유전적, 전염 성 에이전트와 일으키는 microcephaly4,,56,,78에 연결 하는 환경 요인에 multifactorial 9. ZIKV 2015-2016 발발 전에 10000 출생에서 8 어린이 microcephaly10CDC 따르면 미국에서 진단 했다. 에 2 월 1일 2016 년 세계 보건 기구 선언 Zika 바이러스 microcephaly 진단 어머니11, ZIKV 감염과 관련 된 놀라운 증가로 인해 국제 관심사의 공중 보건 비상 사태 12. 미국에서 ZIKV 경우에 CDC에서 최근 연구 개발 microcephaly 미국에서 감염 되지 않은 개인, 및 ZIKV 감염 어머니의 4%에 비해 자녀에 대 한 위험을 증가 20-fold에 모성 ZIKV 감염 결과 귀착되 었 제안 microcephaly11아이 들. 브라질의 ZIKV 감염에서 임신 중 microcephaly 관련 된 출생 결함의 비율 최대 17% 라틴 아메리카에 있는 다른 요인 위험 증가에 기여 수 있습니다 나타내는 감염 된 어머니에 아기의 영향을 보고 되었습니다. 13. 우리는 ZIKV은 신경 조상 세포 (NPC) 인구7,,814는 microcephaly pathogenesis 발생할 수 있습니다 알고, 하는 동안 개발에 ZIKV의 완전 한 병 인 뇌 애매 하 게 남아 있다. 그것은 더 ZIKV 감염과 관련 된 뇌 이상이 기본 질병 메커니즘을 조사 하기 위해 동물 모델을 개발 하는 것이 중요입니다.
직접 효과 ZIKV는 두뇌 개발에 연구, 우리는 먼저 ZIKV7배아 일 14.5 (E14.5) 두뇌의 intracerebral 접종을 사용 하 여 마우스 모델을 개발 했다. 이 단계는 인간의 임신14첫 번째 임신의 끝의 대표자 이라고 여겨진다으로 선정 되었다. 새끼는 출생 후 하루 5 (P5)이 배아 intracerebral 주입 방법으로 살아남을 수 (~ 106 조직 문화 감염 복용량 (TCID50/mL) x 1.7의 1 µ L). 이러한 산 후 새끼 고기 마찬가지로 확대 심, 신경 손실, axonal 희박, astrogliosis, 및 microglial 활성화12,15를 포함 하 여 감염 된 인간 유아에서 관찰의 범위를 전시 한다. 신생아 쥐의 뇌 중간 임신16, 인간 두뇌의 발달 단계에 가깝다 상대적으로 성숙 이며 마우스 두뇌 개발 주요 출생 후 구성 요소를 포함 합니다. 공부 하 고 나중에 임신 단계 감염, 출생 후 감염에 대 한 방법은 또한 설명 합니다. 신생아 감염 p 1에서 ZIKV 13 일 후 주입에 살아남을 수 있습니다. 혈액 태어난 성인 무대 감염 마우스 이전17 만 사용 해야 합니다에 설명 하 고 인터페론 (IFN) 규정 요인 (IRF) 녹음 방송 요인 IRF-3,-5,-7 트리플 녹아웃 스트레인. 이 프로토콜 murine 모델은 성인에서의 항 바이러스 반응 억제를 회피 하는 intraventricularly ZIKV를 접종 하는 방법을 설명 합니다. 동안이 circumvents murine 면역 시스템, 주입의이 경로 감염의 전형적인 경로 모방 직접 않습니다. 이러한 불일치를 해결 하기 위해 직접는 실험 intracranial 경로 대신 ZIKV의 자궁내 감염을 수행할 수 있습니다. 이전 작업18채택, 우리 간단히이 배아 감염 프로토콜에서이 기법을 설명 했습니다.
이 기술로 구현 Zika 바이러스 변종 멕시코 격리 MEX1-447,19 와 아프리카 씨-766 194720에 고립 된 분리 있습니다. Zika MEX1-44 감염된 Aedes aegypti 에서 2016 년 1 월에에서 치아 파스, 멕시코에서 분리 되었습니다 모기. 우리는 텍사스 대학 의료 지점 Galveston (UTMB)에서 통해 권한이 있는이 바이러스를 얻었다. 또한, 뎅기열 바이러스 serotype 2 (DENV2)이이 기법을 사용 하 여 비교 연구에 주사 했다. DENV2, 스트레인 S16803 (시퀀스 은행 GU289914), 1974 년에 태국에서 환자 샘플 로부터 격리 했다 및 C6/36 셀에 passaged. 바이러스는 passaged Vero 세포에 (서) 두번 세계 참조 센터 신흥 바이러스 및 Arboviruses (WRCEVA)에 대 한 마우스 주사 하기 전에. 이이 기술을 동일 하 게 작동 하는 방법을 보여 줍니다 ZIKV 및 두뇌 발달에 영향을 미칠 수 있는 다른 flaviviruses의 다양 한 변종에 대 한 잘.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 설명 하는 것은 두뇌 개발에 ZIKV 유도 손해의 조사에 대 한 미 발달, 신생아, 및 성인 단계에는 ZIKV의 intracerebral 접종에 대 한 방법이입니다. 동안 간단, 조사 연구의 품질 및 그 참여의 안전을 보장 하기 위해 취해야 하는 몇 가지 고려 사항이 있다.
DENV는 flavivirus 속에 ZIKV 밀접 하 게 관련 있다. DENV 하지 원인이 인 간에 있는 소아 뇌 장애와 연결 되어있다. DENV2 수 있습니…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 그의 멘토링 및 토론에 대 한 로체스터의 대학에 박사 Abdellatif Benraiss 성인 수술과 신생아 기법 학습 관련 인정 하 고 싶습니다. 저자 또한 자신의 stereotaxic 장비 및 토론의 사용을 위한 UGA에서 박사 제임스 로더 데 일이이 기술에 대 한 방법론 및 연구 대학 과학자 (호) 재단 발전 관련을 인정 하 고 싶습니다 그들의 지원 및 우리의 NIH 지원 (NINDS 부여 R01NS096176-02, R01NS097231-01, & F99NS105187-01).
Materials
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | – | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | – | |
| Mineral Oil | VWR | – | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
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