Établir des modèles de souris pour troubles neurologiques Zika Viro-induite à l’aide de stratégies d’Injection intracérébrale : embryonnaires, néonatals et adultes
Summary
Nous décrivons ici une méthode pour établir un modèle de Zika Viro-induite microcéphalie chez la souris. Ce protocole inclut des méthodes pour l’inoculation intracérébrale embryonnaire, néonatale et adulte-stade du virus Zika.
Abstract
Le virus Zika (ZIKV) est un flavivirus actuellement endémique dans le Nord, centrale et l’Amérique du Sud. Il est maintenant établi que le ZIKV peut entraîner une microcéphalie et des anomalies cérébrales supplémentaires. Toutefois, le mécanisme sous-jacent à la pathogenèse de ZIKV dans le cerveau en développement reste peu clair. Les méthodes chirurgicales intracérébrales sont fréquemment utilisés dans la recherche en neurosciences pour répondre aux questions sur le développement cérébral normal et anormal et le fonctionnement du cerveau. Ce protocole utilise des techniques chirurgicales classiques et décrit des méthodes qui permettent de maladie neurologique humaine du ZIKV-associés-modèle dans le système nerveux de la souris. Alors que l’inoculation directe cerveau ne modélise pas le mode normal de transmission du virus, la méthode permet aux enquêteurs à poser des questions ciblées sur la conséquence après infection de ZIKV du cerveau en développement. Ce protocole décrit des stades embryonnaires, néonatals et adultes d’inoculation intraventriculaire de ZIKV. Une fois maîtrisé, cette méthode peut devenir une technique simple et reproductible qui ne prend que quelques heures à effectuer.
Introduction
Microcéphalie est un état résultant de l’évolution de cerveau défectueux caractérisée par plus petit que la taille moyenne de la tête chez le nouveau-né. Enfants avec microcéphalie présentent une série de symptômes qui peuvent comprendre un retard de développement, saisie, déficience intellectuelle, surdité, troubles de la vue et problèmes avec le mouvement et l’équilibre, entre autres, selon la gravité de la maladie et causer1,2,3. Cette condition est multifactorielle dans la nature, avec agent génétique, infectieux et des facteurs environnementaux liés aux provoquant une microcéphalie4,5,6,7,8, 9. Avant le déclenchement de 2015-2016 ZIKV, 8 enfants sur 10 000 naissances ont été diagnostiqués avec microcéphalie aux États-Unis selon le CDC10. Sur Février 1st de 2016, l’Organisation mondiale de la santé a déclaré le virus Zika un enjeu de santé publique d’urgence de l’International en raison de l’augmentation alarmante des diagnostics de microcéphalie associée à une infection ZIKV mères11, 12. Une étude récente de la CDC sur les cas ZIKV aux États-Unis suggère que la maternelle ZIKV infection entraîne un risque 20 fois pour un enfant de développer une microcéphalie par rapport aux personnes non infectées et 4 % de mères ZIKV infecté des USA ont donné lieu à enfants avec microcéphalie11. Le taux d’anomalies congénitales associées à une microcéphalie pendant la grossesse de l’infection de ZIKV au Brésil ont été signalés ont touché jusqu’à 17 % des bébés de mères infectées, ce qui indique qu’en Amérique latine des autres facteurs peuvent contribuer à l’augmentation du risque 13. alors que nous savons que le ZIKV peut entraîner une microcéphalie et pathogenèse progénitrices neurales cellulaire (NPC) population7,8,14, la pathogenèse complete de ZIKV dans le développement du cerveau reste insaisissable. Il est important de développer des modèles animaux afin d’étudier les mécanismes de la maladie qui sous-tendent les anomalies du cerveau associées à une infection ZIKV.
Etudier directement l’effet de la ZIKV sur le développement du cerveau, nous avons tout d’abord développé un modèle de souris à l’aide de l’inoculation intracérébrale du cerveau (E14.5) 14,5 de jour embryonnaire avec ZIKV7. Ce stade a été choisi car il est considéré comme représentant de la fin du premier trimestre de la gestation humaine14. Chiots peuvent survivre jusqu’à jour après la naissance 5 (P5) avec cette méthode d’injection intracérébrale embryonnaire (~ 1 µL de 1,7 x 106 vitroplants dose infectieuse (TCID50/mL)). Ces chiots postnatals présentent une gamme des phénotypes de même chez les nourrissons humains infectés y compris les ventricules, perte neuronale, raréfaction axonale, astrogliosis et microglial activation12,15. Un cerveau de souris nouveau-né est relativement immature, proche du stade de développement du cerveau humain au milieu de la gestation,16, et développement de cerveau de souris comprend une composante majeure de postnatale. Afin d’étudier plus tard infections stade de gestation, une méthode d’infection postnatale est également décrite. Les nouveau-nés infectés par ZIKV au P1 sont capables de survivre jusqu’à à 13 jours après injection. Infection de sang-né un stade adulte a été décrit chez la souris auparavant17 mais nécessite l’utilisation de facteurs de la transcription de facteur régulateur (IRF) de l’interféron (IFN) IRF-3, -5, souche triple-7. Ce protocole décrit une méthode d’inoculation ZIKV intraventriculaire pour contourner la désactivation de la réponse antivirale du modèle murin chez l’adulte. Alors que cela contourne le système immunitaire murin, cette voie d’injection n’imite pas directement la voie typique d’infection. Pour résoudre cette divergence, l’expérimentateur peut exécuter directement une infection intra-utérine de ZIKV au lieu de la voie intracrânienne. Adopté du précédent travail18, nous avons décrit brièvement cette technique dans le présent protocole embryonnaire de l’infection.
Les souches de virus Zika mis en oeuvre avec cette technique sont l’isolat mexicain MEX1-447,19 et l’africain isoler M.-766, isolé en 194720. Zika MEX1-44 a été isolé au Chiapas, au Mexique en janvier de 2016 d’un infecté Aedes aegypti moustique. Nous avons obtenu ce virus avec la permission par le biais de l’University of Texas Medical Branch à Galveston (UTMB). En outre, le sérotype de virus de la Dengue 2 (DENV2) a été inoculé à l’aide de cette technique dans une étude de comparaison. DENV2, souche S16803 (séquence GenBank GU289914), a été isolé dans un échantillon de patient de Thaïlande en 1974 et repiquées dans les cellules C6/36. Le virus a été repiquée deux fois dans les cellules Vero par le centre de référence mondial pour virus émergents et les arbovirus (WRCEVA) avant les injections de souris. Cela démontre que cette technique fonctionne aussi bien pour les diverses souches de ZIKV et autres flavivirus qui peuvent avoir un impact sur le développement du cerveau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Décrite ici est une méthode pour l’inoculation intracérébrale de la ZIKV à des stades embryonnaires, néonatals et adultes d’enquête sur les dommages induits par ZIKV dans le développement du cerveau. Bien que simple, il y a quelques considérations que les enquêteurs devraient prendre pour assurer la qualité de l’étude et la sécurité des personnes impliquées.
Ministère de l’environnement est étroitement liée à ZIKV du genre flavivirus. Ministère de l’environnement …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimerait remercier les Dr Abdellatif Benraiss à l’Université de Rochester pour son mentorat et des discussions pertinentes à l’apprentissage des adultes chirurgicaux et des techniques de nouveau-né. Les auteurs aimerait également remercier Dr James Lauderdale à UGA pour l’utilisation de son équipement stéréotaxique et discussions liées à la mise en place de la méthodologie utilisée pour cette technique et à la promotion de la Fondation Collège de recherches scientifiques (ARCS) pour leur appui et notre soutien de NIH (NINDS accorde R01NS096176-02, R01NS097231-01 et F99NS105187-01).
Materials
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | – | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | – | |
| Mineral Oil | VWR | – | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
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