Mausmodelle für Zika-Virus-induzierte neurologische Erkrankungen mit intrazerebrale Injektion Strategien etablieren: embryonale, Neugeborene und Erwachsene
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode für den Aufbau eines Modells von Zika virusbedingte Mikrozephalie in Maus. Dieses Protokoll enthält Methoden zum embryonalen, Neugeborenen und Erwachsenen-Bühne intrazerebrale Inokulation von Zika-Virus.
Abstract
Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein Flavivirus derzeit in Nord-, Mittel- und Südamerika weit verbreitet. Es ist jetzt festgestellt, dass die ZIKV Mikrozephalie und zusätzliche Gehirn Anomalien verursachen kann. Der Mechanismus der Pathogenese von ZIKV in das sich entwickelnde Gehirn bleibt jedoch unklar. Intrazerebrale Operationsmethoden werden häufig in der neurowissenschaftlichen Forschung Fragen über normalen und abnormalen Hirnentwicklung und Funktion des Gehirns verwendet. Dieses Protokoll nutzt klassische Operationstechniken und beschreibt Methoden, die ein Modell ZIKV-assoziierten neurologischen Krankheiten des Nervensystems Maus zu lassen. Während direkte Gehirn Impfung nicht den normalen Modus der Virenübertragung Modell, kann die Methode Ermittler, gezielte Fragen über die Folge nach ZIKV Infektion der das sich entwickelnde Gehirn. Dieses Protokoll beschreibt embryonale, Neugeborene und Erwachsene Phasen der intraventrikulären Inokulation von ZIKV. Einmal gemeistert, kann diese Methode eine einfache und reproduzierbare Technik werden, die dauert nur ein paar Stunden durchzuführen.
Introduction
Mikrozephalie ist eine Erkrankung, die durch defekte Gehirnentwicklung gekennzeichnet durch kleiner als durchschnittliche Kopfumfang bei Neugeborenen. Kinder mit Mikrozephalie weisen eine Reihe von Symptomen, darunter für Entwicklungsverzögerung, Beschlagnahme, geistige Behinderung, Schwerhörigkeit, Sehstörungen und Probleme mit Bewegung und Gleichgewicht, unter anderem abhängig von der Schwere der Erkrankung und Ursache1,2,3. Diese Bedingung ist multifaktoriell, in der Natur, mit genetischen, infektiöse Agenten und Umweltfaktoren verbunden, Mikrozephalie,4,5,6,7,8zu verursachen, 9. Vor dem Ausbruch 2015-2016 ZIKV waren 8 Kinder von 10.000 Geburten mit Mikrozephalie in den Vereinigten Staaten nach der CDC-10diagnostiziert. Am Februar 1St 2016 die Weltgesundheitsorganisation erklärte der Zika-Virus eine Public Health Notlage von internationaler Tragweite aufgrund der alarmierenden Zunahme Mikrozephalie Diagnosen zugeordnet ZIKV Infektion in Mütter11, 12. Eine aktuelle Studie aus der CDC ZIKV Fälle in den Vereinigten Staaten legt nahe, dass mütterliche ZIKV Infektion führt in ein 20-fold erhöhtes Risiko für ein Kind, Mikrozephalie, im Vergleich zu nicht infizierten Personen und 4 % der ZIKV infizierte Mütter aus den USA zu entwickeln geführt haben Kinder mit Mikrozephalie11. Die Rate der Mikrozephalie assoziierten Fehlbildungen während der Schwangerschaft von ZIKV Infektion in Brasilien gemeldet wurden, betroffen sind bis zu 17 % der Babys in infizierten Müttern, darauf hinweist, dass andere Faktoren in Lateinamerika auf das erhöhte Risiko beitragen kann 13. während wir wissen, dass die ZIKV in den neuronalen Vorläuferzellen Zelle (NPC) Bevölkerung7,8,14Mikrozephalie und Pathogenese führen kann, die komplette Pathogenese von ZIKV in der Entwicklung des Gehirns bleibt schwer. Es ist wichtig, Tiermodelle um weiter zu untersuchen, die Krankheitsmechanismen, die die Gehirn Anomalien ZIKV Infektion zu entwickeln.
Um direkt die Wirkung zu untersuchen, die die ZIKV auf die Entwicklung des Gehirns hat, haben wir zuerst ein Maus-Modell mit ZIKV7intrazerebrale Inokulation von embryonalen Tag 14,5 (E14.5) Gehirn entwickelt. Diese Phase wurde gewählt, weil es als repräsentativ für das Ende des ersten Trimesters in menschlichen Schwangerschaft14 gilt. Welpen können mit dieser Methode der embryonalen intrazerebrale Injektion bis zu postnatalen Tag 5 (P5) überleben (~ 1 µL von 1,7 x 106 Gewebekultur Infektionsdosis (TCID50/mL)). Diese postnatalen Welpen zeigen eine Reihe von Phänotypen, die in ähnlicher Weise beobachtet bei infizierten menschlichen Säuglingen einschließlich der erweiterten Ventrikel, neuronaler Verlust axonalen Verdünnung, Astrogliosis und Microglial Aktivierung12,15. Ein Neugeborenes Mäusegehirn ist relativ unreif, vergleichbar mit der Entwicklungsstufe des menschlichen Gehirns bei Mid Schwangerschaftswoche16und Maus Gehirnentwicklung umfasst eine postnatale Hauptkomponente. Um späteren Schwangerschaft Bühne Infektionen zu studieren, ist eine Methode für die postnatale Infektion auch beschrieben. Neugeborene infiziert mit ZIKV auf P1 sind in der Lage, bis zu 13 Tage nach der Injektion zu überleben. Blut geboren Erwachsenstadium Infektion ist beschrieben worden, in der Maus bisher17 aber den Einsatz von erfordert Interferon (IFN) regulatorischen Faktor (IRF) Transkription Faktoren IRF-3,-5-7 triple Knockout-Stamm. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des ZIKV intraventricularly um zu umgehen, Deaktivieren der antiviralen Reaktion des murinen Modells beim Erwachsenen impfen. Während dies das murine Immunsystem umgeht, ist diese Route der Injektion nicht direkt den typischen Weg der Infektion nachahmen. Um diese Diskrepanz zu beheben kann direkt, der Experimentator eine intrauterine Infektion der ZIKV anstelle der intrakraniellen Route durchführen. Aus früheren Arbeiten18übernommen, haben wir diese Technik in diesem Protokoll embryonalen Infektion kurz beschrieben.
Zika Virusstämme umgesetzt mit dieser Technik gehören das mexikanische Isolat MEX1-447,19 und die afrikanischen isolieren Herr-766 in 194720isoliert. Zika MEX1-44 wurde in Chiapas, Mexiko isoliert im Januar 2016 von einem infizierten Aedes Aegypti Mücke. Wir erhalten dieses Virus mit Genehmigung durch die University of Texas Medical Branch in Galveston (UTMB). Darüber hinaus wurde das Dengue-Virus Serotyp 2 (DENV2) geimpft mit dieser Technik in einer Vergleichsstudie. DENV2, Stamm S16803 (Reihenfolge GenBank GU289914), wurde im Jahr 1974 von einer Patientenprobe aus Thailand isoliert und in C6/36 Zellen passagiert. Das Virus wurde zweimal in Vero-Zellen durch die Welt-Referenzzentrum für auftauchende Viren und Arboviren (WRCEVA) vor der Maus Injektionen passagiert. Dies zeigt, dass diese Technik genauso funktioniert gut für verschiedene Stämme von ZIKV und anderen Flaviviren, die sich auf die Entwicklung des Gehirns auswirken können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrieben, ist eine Methode für intrazerebrale Inokulation von der ZIKV in embryonalen, Neugeborene und Erwachsene Stadien für die Untersuchung der ZIKV-induzierten Schäden in die Entwicklung des Gehirns. Während einfach, gibt es ein paar Überlegungen, die Ermittler nehmen sollten, um die Qualität der Studie und die Sicherheit aller Beteiligten zu gewährleisten.
DENV ist ZIKV in der Gattung Flavivirus eng verwandt. DENV ist nicht kausal mit pädiatrischen hirnstörungen bei Mensc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchte Dr. Abdellatif Benraiss an der University of Rochester für seine Betreuung und Diskussionen für die Erwachsenen chirurgische und Neugeborene Techniken zu lernen anerkennen. Die Autoren möchten auch anerkennen, Dr. James Lauderdale am UGA für die Nutzung seiner stereotaktischen Ausrüstung und Diskussionen im Zusammenhang mit der Methodik für diese Technik und die Förderung für Forschung College Wissenschaftler (ARCS) Grundlage für die Einrichtung ihrer Support und Hotline NIH (NINDS gewährt R01NS096176-02, R01NS097231-01 & F99NS105187-01).
Materials
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | – | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | – | |
| Mineral Oil | VWR | – | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
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