Summary

Un metodo pratico per estrazione ed analisi con cromatografia liquida dei neurotrasmettitori della catecolamina e loro metaboliti

Published: March 01, 2018
doi:

Summary

Vi presentiamo una comoda estrazione in fase solida accoppiata alla cromatografia liquida (HPLC) con rivelazione elettrochimica (ECD) per la determinazione simultanea di tre neurotrasmettitori di monoammina e due dei loro metaboliti nelle urine dei bambini. Identifichiamo anche il metabolita MHPG come potenziale biomarcatore per la diagnosi precoce del danno cerebrale per neonati.

Abstract

L’estrazione e l’analisi dei neurotrasmettitori della catecolamina nei fluidi biologici è di grande importanza nel valutare la funzione del sistema nervoso e malattie correlate, ma la loro misura precisa è ancora una sfida. Molti protocolli sono stati descritti per la misura di neurotrasmettitore da una varietà di strumenti, tra cui la cromatografia liquida (HPLC). Tuttavia, ci sono carenze, come funzionamento complicato o difficile da rilevare bersagli multipli, che non possono essere evitate, e attualmente, la tecnica di analisi dominante è ancora HPLC accoppiato con sensibile elettrochimica o rilevazione fluorimetrica, dovuto a sua alta sensibilità e buona selettività. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per il pretrattamento e la rilevazione delle catecolamine con cromatografia liquida ad alta pressione con rilevazione elettrochimica (HPLC-ECD) in campioni di urina reale degli infanti, utilizzando elettrofilate nanofibre composito composte di etere corona polimerici con polistirolo come adsorbente, noto anche come il metodo di estrazione (PFSPE) di fase solida fibra di pranzo. Vi mostriamo come urina campioni possono essere facilmente precleaned da una colonna di nanofibra-pranzo in fase solida, e come gli analiti nel campione possono arricchirsi rapidamente, sotto esame desorbita e rilevata su un sistema ECD. PFSPE semplifica notevolmente le procedure di pretrattamento per campioni biologici, permettendo per tempo in diminuzione, spese e riduzione della perdita di obiettivi.

Nel complesso, questo lavoro illustra un protocollo semplice e conveniente per estrazione in fase solida accoppiato ad un sistema di HPLC-ECD per la determinazione simultanea di tre neurotrasmettitori di monoammina (norepinefrina (NE), epinefrina (E), dopamina (DA)) e due di loro metaboliti (3-metossi-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) e 3,4-diidrossi acido fenilacetico (DOPAC)) nelle urine dei bambini. Il protocollo è stato applicato per valutare le differenze di catecolamine urinarie e loro metaboliti tra neonati ad alto rischio con lesione cerebrale perinatale e controlli sani. Analisi comparativa ha rivelato una differenza significativa in MHPG urinario fra i due gruppi, che indica che i metaboliti delle catecolamine possono essere un indicatore importante candidato per la diagnosi precoce dei casi a rischio di danni di cervello in infanti.

Introduction

Neurotrasmettitori della catecolamina e il loro contenuto di metabolita nei liquidi corporei possa influenzare la funzione neurale e compromettere l’equilibrio degli Stati di risposta a stimolo di una larga misura1. Anormalità può causare una varietà di malattie, quali pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma e disturbi neurologici1,2. L’estrazione e la determinazione delle catecolamine nei liquidi corporei è significativo per la diagnosi delle malattie. Tuttavia, le catecolamine in campioni biologici presenti in basse concentrazioni e sono facilmente ossidate. Inoltre, sono molto difficili eluire a causa della grande quantità di interferenze in media3. Così, la rilevazione simultanea delle catecolamine nei fluidi biologici è ancora una sfida.

Ci sono state recensioni mostrando che le catecolamine urinarie possono essere una misura di stress, e che i loro livelli sono importanti indicatori biologici risponde alla stimolazione tattile elaborazione in neonati5. Secondo la ricerca, tutti gli infanti che hanno sofferto gli incidenti precoce sono a rischio per la ferita di cervello4,5,6, e danno può causare il rilascio anormale delle catecolamine e questioni connesse nei fluidi. Esistono tecniche di risonanza magnetica avanzata che possono rilevare danni al cervello in precedenti fasi7,8. Tuttavia, entro le prime 48 h, un processo anormale neurodevelopmental causerà danno cerebrale permanente che non sarà evidente in immagini mediche11. Inoltre, le risorse di alto costo e scarsa strumento, insieme ad altri fattori, rende impossibile per tutte le unità neonatale di avere accesso a queste tecniche di neuro-imaging per applicazioni specializzate. Tuttavia, l’uso di un biomarcatore facilmente accessibile e pratico (come le catecolamine e loro metaboliti) potrebbe superare queste carenze, e la proiezione di un biomarcatore nei fluidi umani può aiutare nella diagnosi precoce della lesione cerebrale e condurre per richiedere identificazione dei neonati che necessitano di neuroprotezione9. Le catecolamine nelle urine possono essere un indice semplice ed evidente, a causa della correlazione diretta tra la quantità di loro rilasciata fluidi e neuroactivity funzione.

Tra i fluidi biologici, campioni di plasma e del liquido cerebrospinale (CSF) non sono facili da ottenere tramite procedure esistenti traumatiche, e inoltre è molto difficile sbarazzarsi di disturbi causati dalla proteina adesiva e altre impurità, portando a un fastidioso e processo che richiede tempo di campionamento che è inadatto per il rilevamento di ripetute. Inoltre, per i bambini, è quasi impossibile ottenere i campioni in modo traumatico. Pertanto, campionamento urinaria è meglio di altre forme di campionamento, come è non invasivo, facile da usare e può essere fatto più volte. Campioni di urina sono abbondanti e facili da memorizzare e mostrerà grandi vantaggi rispetto alle altre forme di campioni biologici.

I principali metodi per quantificare le catecolamine nei fluidi biologici includono radioenzymic saggi10, enzimo-immunitario-sorbent test11, voltammetria12 e lente termica spettrometria13. Ma esistono carenze, quali operazioni complicate e difficili da rilevare bersagli multipli. Oggi, la tecnica di analisi dominante è ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC)14, accoppiato con sensibili elettrochimico15 o fluorimetrico rilevazione16, a causa della sua alta sensibilità e buona selettività. Con tecnologia di spettrometria di massa tandem, come cromatografia liquida/spettrometria di massa (LC/MS) e liquido cromatografia/spettrometria di massa/spettrometria di massa (LC/MS/MS), l’analisi e la quantificazione dei neurotrasmettitori possono realizzare alto precisione e specificità17,18. Tuttavia, la tecnica MS richiede strumentazione costosa così come sostanzialmente qualificata manodopera, rendendo il metodo difficilmente applicabile universalmente nei laboratori più convenzionali. Sistemi HPLC-ECD sono comunemente dotate di laboratori più convenzionali e clinici e così sono diventati una scelta comune e buona per gruppi di ricerca da utilizzare per la determinazione chimica, ma richiedono il campione introdotto nel sistema per essere pulito e di Microscala volume19. Così, è di grande importanza per purificare e condensare il campione prima dell’analisi. Il metodo classico per la fase di purificazione è estrazione liquido-liquido14,15,20 e off-line estrazione in fase solida, tra cui colonna di allumina attivata21,22 e diphenylborate (DPBA) complessazione23,24,25,26.

Myeongho Lee et al. hanno utilizzato resina polimerica chimicamente con etere corona come adsorbente per estrarre selettivamente le catecolamine da urina umana dal 200727. Inoltre, nel 2006, Haibo He et al. ha dimostrato un approccio facile sintesi per boronato affinità estrazione sorbente byutilizing un composito a base nanomagnetici nanomagnetici functionalizable silsesquioxane oligomerici poliedrici (POSS) e la sua applicazione all’arricchimento delle catecolamine nel urina umana (adrenalina e della noradrenalina, isoprenalina)28. Essi hanno anche approfittato dei nanomateriali a compiere l’opera, utilizzando una tecnologia chiamata nano-elettrofilatura e formando il materiale fibroso di polimero in scala nanometrica. Il processo di elettrofilatura può regolare il diametro e la morfologia spaziale allineamento del prodotto controllando la tensione di lavoro e cambiare il contenuto della soluzione di filatura insieme ad altri parametri29. Confronto con la cartuccia SPE convenzionale, le nanofibre elettrofilate sono molto adatte per estrarre e arricchire analiti bersaglio da una matrice complessa, come sono dotate di elevati rapporti di superficie-zona–volume di adsorbire gli analiti con alta efficienza, e presentano più facilmente controllato superficie proprietà chimiche, che permette il comodo attacco dei composti bersaglio. Queste caratteristiche li rendono buone scelte per adsorbenti SPE, riducendo notevolmente la fase solida e desorbimento quantità solvente30,31,32,33. Per le catecolamine in campioni di urina, le nanofibre elettrofilate composte da etere corona apolymeric con polistirene (PCE-PS) sono state utilizzate per estrarre selettivamente tre catecolamine (NE, E e DA)34. La carta indicata che l’etere corona selettiva adsorbito gli obiettivi di NE, E e DA, che si basava sulla sua corretta geometria per l’associazione di catecolamine via formando legami idrogeno. I risultati visualizzati l’etere corona materiale in modo efficace, eliminando altri composti interferenti contenute in campioni biologici. Ispirato da questo rapporto, un nuovo metodo è stato sviluppato per l’estrazione selettiva delle catecolamine mediante uso di elettrofilate nanofibre composito composte di PCE-PS.

In questa carta, il metodo segnalato precedentemente34 era migliorato e impiegato non solo per analizzare correttamente E, NE e DA, ma anche loro metaboliti, MHPG e DOPAC, nelle urine. Inoltre esploriamo nuove possibilità per il meccanismo del processo di adsorbimento. Il metodo Mostra soddisfacente efficienza di estrazione e selettività per gli cinque analiti, e il metodo è stato verificato nell’analisi delle urine da neonati ad alto rischio con lesione cerebrale perinatale e controlli sani.

Protocol

È stato ottenuto il consenso informato da parte dei genitori, e l’approvazione del Consiglio di revisione istituzionale è stata ottenuta per lo studio. Lo studio è stato effettuato in conformità al codice etico dell’associazione medica mondiale (dichiarazione di Helsinki) per esperimenti su esseri umani. Operatori sanitari di tutti i partecipanti forniti consenso per essere arruolati nello studio. Approvazione del comitato etico dall’ospedale di Zhongda, affiliazione con Southeast University, inoltre è stato ottenut…

Representative Results

Questo protocollo è un metodo semplice e conveniente di PFSPE per pretrattare i campioni di urina e arricchire le cinque catecolamine per il rilevamento tramite un sistema di HPLC-ECD; un diagramma del processo è illustrato nella Figura 1. Il protocollo comprende principalmente quattro passaggi-attivazione, caricamento, risciacquo e medicati – accoppiato con una piccola quantità di nanofibre PCE-PS e un dispositivo semplice estrazione in fase solida. La mo…

Discussion

Il metodo PFSPE proposto nel presente documento può essere significativi e significativi per quanto riguarda la sua rapidità, semplicità e convenienza. Gli adsorbenti utilizzati nel protocollo sono le nanofibre elettrofilate, che hanno elevati rapporti superfici di zona-volume e assorbono gli analiti con alta efficienza. La procedura solo ha bisogno di pochi milligrammi di nanofibra e un piccolo volume di solvente eluente e non richiedono un passaggio di evaporazione per concentrare gli analiti. Qui, abbiamo presentat…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto dal National Foundation Science of China (No.81172720, n. 81673230), sociale sviluppo ricerca programma di Jiangsu Province scienza e dipartimento di tecnologia (No. BE2016741), scienza & tecnologia progetto di Cina Amministrazione generale della supervisione della qualità, ispezione e quarantena (2015QK055), il programma di progetto aperto del laboratorio chiave di sviluppo del bambino e l’apprendimento della scienza del Ministero dell’istruzione, Southeast University (CDLS-2016-04). Riconosciamo sinceramente Song Yuan e Ping Liu, che ci ha aiutato nella raccolta di campioni.

Materials

200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

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Citer Cet Article
Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L., Kang, X. A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites. J. Vis. Exp. (133), e56445, doi:10.3791/56445 (2018).

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