Laser Microirradiation per lo Studio In Vivo delle risposte cellulari al danno al DNA semplici e complesse

In Vivo Segnalazione di danni del DNA non è ben compreso
In vivo, il DNA è complessato con istoni ed altri fattori a fibre di cromatina forma. Regolamento della struttura della cromatina è di fondamentale importanza per il metabolismo del DNA. Ad esempio, la variante dell’istone H2AX viene fosforilata da atassia-teleangectasia mutato (ATM) e altre chinasi seguente doppio-filo si rompe ad induzione (DSB) ed è importante per amplificazione del segnale DSB danni, nonché a fornire un sito di aggancio per altro fattori. Diffusione della scelta di pathway di segnalazione e riparazione danni sembrano essere criticamente influenzati dalla struttura della cromatina locale a danni siti¹. Una serie di fattori, istone chaperoni e modificando gli enzimi istone di rimodellamento della cromatina sono infatti reclutato per danneggiare siti e sono importante per la riparazione del DNA efficiente, evidenziando l’importanza della regolazione della cromatina nella DDR e riparazione^{2 , 3 , 4}. Inoltre, sito danno clustering o il riposizionamento è stato osservato in lievito e drosofila^5,6,7,8, ricordano la rilocalizzazione di loci genici nella subnucleare vano associato gene regolamento^9,10. Recenti studi nel topo e cellule umane anche rivelato mobilitazione dei siti DSB, quali influenze ripristino fedeltà e via scelta^11,12. Ciò solleva la possibilità che DDR/riparazione può anche essere intimamente legato al architettura nucleare, l’organizzazione di ordine superiore della cromatina e cromosoma dynamics nel nucleo della cellula. Quindi, è fondamentale per sviluppare metodi ad alta risoluzione per studiare DDR e processi nel contesto dell’ambiente endogeno nucleare in una cellula viva di riparazione al fine di comprendere le conseguenze a breve e a lungo termine di danno del DNA.

Ruolo critico di PAR polimerasi (PARP) nel valutare l’entità e il tipo di danno e regolamentare proteina Assemblea presso il sito di danni
PARP1 è un sensore di nick DNA rapidamente attivato da danno del DNA che svolge un ruolo critico nel DNA riparazione¹³. PARP1 è stato originariamente pensato per funzionare insieme con raggi x riparare Cross completando 1 (XRCC1) per facilitare la riparazione bassa di asportazione (BER), ma gli studi recenti rivelano il suo ruolo in altre vie di riparazione del DNA, compreso DSB riparazione¹⁴. Attivato PARP1 usi nicotinamide adenina dinucleotide (NAD⁺) da un substrato ad ADP-ribosylate più proteine bersaglio, compreso se stesso. Questo enzima e altri membri della famiglia hanno attirato molta attenzione negli ultimi anni come inibitori PARP sono emersi come promettenti farmaci terapeutici per i tumori. Sebbene gli inibitori PARP inizialmente sono stati trovati per essere efficace nel gene del cancro al seno (BRCA)-mutato di cellule di cancro al seno, ora c’è una pletora di prova per i loro effetti nelle terapie di combinazione e mono – insieme offensivi agenti/irradiazione contro del DNA un ampio spettro di tumori con mutazioni non limitate a BRCA^{15,16,17,18,19,20}.

A livello molecolare, l’attivazione di PARP è stata indicata per giocano un ruolo critico nell’organizzare la struttura locale della cromatina nei siti di danno. Assunzione di PAR-dipendente di enzimi di modificazione della cromatina facilita la riparazione DSB e dettami ripristino scelte di percorso, suggerendo il ruolo importante dell’armatura di PAR modifica presso siti di danno. ¹³,^{21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31} , recentemente abbiamo dimostrato l’esclusione della p53-binding protein 1 (53BP1) da danni siti di PAR ³², fornendo una spiegazione alternativa per 53BP1-dipendente iperattivazione di endjoining non-omologo ( NHEJ) di PARP inibitore e mettendo in evidenza l’importanza di PARP in DSB riparazione via scelta^33,34. PARP1 anche direttamente PARylates e colpisce l’attività del DNA più riparare fattori¹⁴.

Usando il Laser Microirradiation come strumento per studiare DDR/riparazione In Vivo
Microirradiation laser per produrre alterazioni di sub-micron sui singoli cromosomi era in primo luogo descritto nel 1969³⁵ ed esaminate dettagliatamente nel 1981³⁶. Alcuni decenni più tardi, laser microirradiation è stato indicato per indurre il danno del DNA in una regione definita submicrometrici nel nucleo della cellula ed è stato dimostrato di essere una tecnica importante per lo studio di reclutamento o modifiche dei vari fattori per DNA lesioni in vivo ^{13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41}. questo metodo permette la rilevazione di quei fattori che non fanno i fuochi indotta per irradiazione distinti (Martina) a danni siti^39,42. È anche possibile esaminare la dinamica spazio-temporale dei cambiamenti strutturali della cromatina sia a siti di danno che nel resto del nucleo. Abbiamo confrontato con attenzione il DDR indotto da sistemi laser diversi e poteri per valutare la relazione tra il tipo di danno del DNA e il microirradiation condizioni^{32,43,44, di input 45}. I modelli di reclutamento aberrante di 53BP1 e telomerica ripetere fattore legante 2 (TRF2) sono stati osservati negli studi precedenti danni laser, che ha fornito la base per la ricorrente preoccupazione per la natura “non fisiologica” del danno indotto da laser^{46 ,47,48,49}. Abbiamo trovato che queste apparenti discrepanze ora potrebbero essere spiegate da PARP differenziale che misura la quantità e la complessità del danno indotto³²di segnalazione. Abbiamo confermato che: 1) laser-microirradiated cellule (anche dopo irradiazione di potenza di ingresso alta) vengono arrestate in interfase in un modo di controllo-dipendente di checkpoint danni e rimanere vitali (almeno fino a 48 h)^32,50; e 2) riparazione fattore reclutamento/modifiche ricapitolare fedelmente quelle osservate con il trattamento con agenti offensivi del DNA convenzionali ed induzione di DSB da endonucleasi^{32,39,42, 44,50,51,52}. Questi risultati sostengono fortemente la rilevanza fisiologica di studiare laser indotta da danno risposte cellulari.