Summary

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

Published: January 31, 2018
doi:

Summary

Het doel van dit protocol is te beschrijven hoe laser microirradiation voor het opwekken van verschillende soorten DNA-beschadiging, met inbegrip van relatief eenvoudige strand einden en complexe schade, aan de studie van DNA schade signalering en reparatie factor montage op schade sites in vivo .

Abstract

DNA-beschadigingen induceert specifieke signalering en reparatie reacties in de cel, die is van cruciaal belang voor de bescherming van de integriteit van het genoom. Laser microirradiation werd een waardevol experimentele instrument te onderzoeken de DNA schade reactie (DDR) in vivo. Hierdoor real-time hoge resolutie eencellige analyse van macromoleculaire dynamiek in reactie op laser-veroorzaakte schade beperkt tot een submicrometer regio in de celkern. Verschillende laser omstandigheden zijn echter gebruikt zonder waardering van verschillen in de soorten schade veroorzaakte. Dientengevolge, de aard van de schade is vaak niet goed gekenmerkt of gecontroleerd, waardoor de schijnbare tegenstrijdigheden in de aanwerving of wijziging profielen. We toonden aan dat verschillende bestraling voorwaarden (d.w.z., verschillende golflengten evenals verschillende input bevoegdheden (irradiances) van een femtoseconde (fs) nabij-infrarood (NIR) laser) proteïne assembly’s van verschillende DDR en reparatie geïnduceerde. Dit weerspiegelt het soort DNA schade geproduceerd. Dit protocol beschrijft hoe titratie van laser ingangsvermogen toestaat inductie van verschillende hoeveelheden en complexiteit van de DNA-beschadiging, die gemakkelijk kan worden gecontroleerd door detectie van base en crosslinking schade, differentiële poly (ADP-ribose) (PAR) signalering, en traject-specifieke reparatie factor assemblages op schade sites. Nadat de schade-voorwaarden zijn vastgesteld, is het mogelijk om te onderzoeken van de effecten van verschillende schade complexiteit en differentiële schade signalering en uitputting van de upstream factor(en) op enige factor van belang.

Introduction

In Vivo DNA schade signalering is niet goed begrepen
In vivo, is DNA complexvorm met histonen en andere factoren aan formulier chromatine vezels. Regulering van de structuur van de chromatine is van het allergrootste belang voor DNA-metabolisme. Bijvoorbeeld, is de Histon variant H2AX phosphorylated door Ataxie Teleangiëctasie gemuteerd (ATM) en andere kinases volgende dubbel-strand (DSB) inductie breekt, en is belangrijk voor DSB schade signaal versterking, alsmede het verstrekken van een docking site voor andere factoren. Verspreiding van schade signalering en reparatie traject keuze lijken te kritisch worden beïnvloed door lokale chromatine structuur bij schade sites1. Een aantal chromatine remodeling factoren, histone chaperones en Histon wijzigen enzymen inderdaad schade sites worden gerekruteerd en zijn belangrijk voor efficiënte DNA-reparatie, benadrukken het belang van chromatine verordening in de DDR en2 reparatie , 3 , 4. bovendien schade site clustering of herpositioneren werd waargenomen in gist en drosophila5,6,7,8, die doet denken aan Herlokalisatie van gene loci in de subnuclear compartiment gene verordening9,10is gekoppeld. Recente studies in muizen en menselijke cellen bleek ook mobilisatie van DSB sites, welke invloeden trouw en traject keuze11,12 repareren. Dit leidt tot de mogelijkheid dat DDR/reparatie ook worden nauw met nucleaire architectuur, organisatie van de chromatine van hogere-orde en chromosoom dynamiek in de celkern verbonden kan. Het is dus een kritische studie van de DDR en herstelprocessen in het kader van de endogene nucleaire omgeving in een levende cel om te begrijpen van de korte – en lange termijn gevolgen van DNA-beschadiging high-resolution methoden te ontwikkelen.

Kritische rol van PAR Polymerase (PARP) in het meten van de omvang en de soort schade en het regelen van eiwit vergadering op de Site van de schade
PARP1 is een DNA nick sensor snel geactiveerd door DNA-schade die een cruciale rol in DNA reparatie13 speelt. PARP1 was oorspronkelijk gedacht te functioneren samen met X-Ray repareren Cross aanvulling 1 (XRCC1) ter vergemakkelijking van de base excision repair (BER), maar recente studies onthullen haar rol in andere DNA repair pathways, met inbegrip van DSB reparatie14. PARP1 gebruik nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) geactiveerd als substraat om ADP-ribosylate meerdere doel eiwitten, met inbegrip van zelf. Dit enzym en andere familieleden hebben aangetrokken veel aandacht in de afgelopen jaren als PARP-remmers als veelbelovende therapeutische geneesmiddelen voor kanker opgedoken. Hoewel de PARP-remmers bleken aanvankelijk te worden effectief in het borstkankergen (BRCA)-gemuteerd borstkankercellen, er is nu een overvloed aan bewijs voor de gevolgen daarvan in mono- en combinatie therapieën samen met DNA beschadigen agenten/bestraling tegen een breed spectrum van kanker met mutaties niet beperkt tot BRCA15,16,17,18,19,20.

Op moleculair niveau, werd PARP activering getoond om te spelen belangrijke rol bij het organiseren van de structuur van de lokale chromatine op schade sites. PAR-afhankelijke aanwerving van chromatin wijziging enzymen vergemakkelijkt DSB reparatie en dicteert herstel traject keuzes, suggereren de belangrijke steigers rol van PAR wijziging op schade sites. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 we onlangs aangetoond de uitsluiting van p53-bindend-proteïne 1 (53BP1) tegen schade door PAR 32, bieden een alternatieve verklaring voor 53BP1-afhankelijke hyperactivering van niet-homologe endjoining (sites NHEJ) door de PARP-remmer en het benadrukken van het belang van PARP in DSB repareren traject keuze33,34. PARP1 ook factoren rechtstreeks PARylates en is van invloed op de activiteit van meerdere DNA repair14.

Met behulp van Laser Microirradiation als een instrument om te studeren DDR/reparatie In Vivo
Laser microirradiation tot sub micron wijzigingen op afzonderlijke chromosomen werd eerst beschreven in 196935 en herzien in detail in 198136. Enkele decennia later, laser microirradiation bleek voor het opwekken van DNA-beschadiging op een gedefinieerde submicrometer regio in de celkern, en bleek te zijn een waardevolle techniek te studeren aanwervings- en wijzigingen van verschillende factoren aan DNA laesies in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. deze methode maakt de ontdekking van de factoren die geen aparte bestraling-geïnduceerde foci (IRIF vormen) bij schade sites39,42. Het is ook mogelijk om te onderzoeken de spatio dynamiek van chromatine structurele wijzigingen zowel op schade plaatsen en in de rest van de kern. Wij zorgvuldig ten opzichte van de DDRs die zijn geïnduceerd door verschillende laser-systemen en de inbreng van de bevoegdheden om te evalueren van de relatie tussen het type van DNA-schade en de microirradiation voorwaarden32,43,44, 45. De afwijkende werving patronen van 53BP1 en Telomere Herhaal bindende factor 2 (TRF2) werden waargenomen in de vorige laser schade studies, die vormde de basis voor de terugkerende zorg voor de “niet-fysiologische” aard van de laser-veroorzaakte schade46 ,47,48,49. We vonden dat deze duidelijk verschillen nu kon worden verklaard door differentiële PARP signalering die meters de hoeveelheid en complexiteit van geïnduceerde schade32. We bevestigd dat: 1) laser-microirradiated cellen (zelfs na hoge input-power bestraling) in interfase in een schade checkpoint controle-afhankelijke manier worden gearresteerd en levensvatbaar blijven (minstens tot 48 h)32,50; en 2) reparatie factor werving/wijzigingen getrouw recapituleren die waargenomen met de behandeling met conventionele DNA schadelijke stoffen en DSB inductie door enzym32,39,42, 44,,50,51,52. Deze resultaten is groot voorstander van de fysiologische relevantie van het bestuderen van laser schade-geïnduceerde cellulaire reacties.

Protocol

1. fundamentele cel voorbereiding Opmerking: Deze stap is voor standaard immunofluorescentie detectie van de endogene eiwit aanwerving of wijziging, en voor het gebruik van een cellijn stabiel uiten een fluorescently tagged recombinant eiwit. Bijvoorbeeld, studie Potorustridactylus (PtK2) buideldier nier epitheliale cellen stabiel uiting van EGFP-53BP11220-1711 of -TRF2-YFP werden gebruikt in onze eerdere (Figuur 1)32. In …

Representative Results

PtK2 cuvetten stabiel uiting van EGFP-53BP11220-1711 of -TRF2-YFP, werd laser ingangsvermogen titratie uitgevoerd om te bepalen van de optimale voorwaarde voor hun werving (Figuur 1)32. Op hoge input-vermogen laser schade sites, de aanzienlijke clustering van BPR (crosslinking schade meestal gegenereerd door ultraviolet (UV) schade) evenals GFP-NTH1 DNA-glycosylase die specifiek base schade herkent werden waargenomen. Daarnaast w…

Discussion

De voordelen van het gebruik van laser microirradiation voor DDR onderzoek zijn:

1. het is haalbaar voor het opwekken van verschillende typen en hoeveelheden DNA schade van eenvoudige strand einden aan complexe DNA-beschadiging op te sporen verschillende reparatie factoren op het DNA beschadigen sites door de laser bestraling parameters aan te passen. Het is ook mogelijk om meerdere keren in de dezelfde celkern schade toebrengen, teneinde de trans effecten (zoals in <strong class="xfi…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Dr. Akira Yasui bij Universiteit van Tohoku, Japan voor het GFP-NTH1 expressie plasmide, en Dr. Eros Lazzerini Denchi aan het The Scripps Research Institute, La Jolla, Californië voor de TRF2-YFP en EGFP-53BP11220-1711 expressie plasmiden. Dit werk werd gesteund door de Air Force Office voor wetenschappelijk onderzoek (FA9550-04-1-0101) en de Beckman Laser Institute Inc Foundation (M.W.B), de Ford Foundation Fellowship van de nationale Academie van Wetenschappen (aan B.A.S), en NSF MCB-1615701 en CRCC CTR-17-426665 (naar K. Y.).

Materials

Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 

References

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread–chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R., Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed?. Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A., Piccart, M. An update on PARP inhibitors–moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O’Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Play Video

Citer Cet Article
Kong, X., Cruz, G. M., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).

View Video