JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Génétique

Лазерная Microirradiation учиться в Vivo клеточных реакций на повреждение ДНК простых и сложных

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/56213
, , , , , ,
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine,University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic,University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences,University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery,University of California, Irvine

Summary

Цель настоящего Протокола заключается в описывается использование лазера microirradiation побудить различные типы повреждений ДНК, включая перерывы относительно простой нити и сложные повреждения, для изучения ДНК повреждения сигнализации и ремонт фактор Ассамблеи в местах повреждения в естественных условиях .

Abstract

Повреждение ДНК индуцирует конкретные ответы сигнализации и ремонт в ячейку, которая имеет решающее значение для защиты целостности генома. Лазерная microirradiation стал ценным экспериментальный инструмент для расследования в ДНК повреждения ответ (РДР) в естественных условиях. Это позволяет анализ в реальном времени с высоким разрешением одноклеточных макромолекулярных динамики в ответ на лазерно индуцированным ущерб ограничивается субмикронной регионом в ядре клетки. Однако без признания различий в типах индуцированного повреждения были использованы различные условия лазера. В результате, характер повреждения часто не является хорошо характеризуется или под контролем, вызывая явного несоответствия в вербовки или изменения профилей. Мы продемонстрировали, что различные облучения условий (т.е., различных длинах волн а также различных входных полномочия (irradiances) Фемтосекундные (fs) ближней ИК-области спектра (NIR) лазера) индуцированной различные DDR и ремонт сборки белков. Это отражает тип повреждения ДНК производства. Этот протокол описывает, как титрования входной мощности лазера позволяет индукции различных объемов и сложности повреждения ДНК, которая может легко контролироваться обнаружения базы и сшивки убытков, дифференциальные поли (АДФ рибоза) (PAR) сигнализации, и путь конкретных ремонт фактор сборки в местах повреждения. После того, как ущерб условия определяются, можно исследовать эффекты сложности различных повреждений и дифференциальные повреждения сигнализации, а также истощение вверх по течению factor(s) на любой фактор интереса.

Introduction

В естественных условиях Повреждения ДНК сигнализации является не вполне понятны
В естественных условиях, ДНК complexed с гистонами и другие факторы, чтобы волокна chromatin формы. Регулирование структуры хроматина имеет первостепенное значение для метаболизма ДНК. Например вариант гистон H2AX фосфорилированных мутировал атаксии телеангиэктазии (ATM) и другие киназы следующие двухнитевые разрывы индукции (DSB) и имеет важное значение для усиления сигнала DSB ущерб, а также обеспечение закрепления сайта для других факторов. Распространяя ущерб сигнализации и ремонта пути выбора, как представляется, быть критически под влиянием местных хроматина структуры в ущерб сайтов1. Количество chromatin remodeling факторов, сопровождающих гистона и изменения ферментов Гистон набираются действительно повредить сайты и имеют важное значение для эффективного восстановления ДНК, подчеркнув важность регулирования хроматина в ГДР и ремонт2 , 3 , 4. Кроме того, ущерб сайт кластеризации или перемещение было отмечено в дрожжей и дрозофилы5,6,,7,8, напоминает relocalization генных локусов в субатомные отсек, связанный с геном правила9,10. Недавние исследования в клетки человека и мыши также показали мобилизацию DSB сайтов, которые влияний ремонт верности и путь выбор11,12. В этой связи возникает возможность, что DDR/ремонт может также быть тесно связан с ядерной архитектуры, организации хроматина более высокого порядка и хромосомы динамика в ядре клетки. Таким образом крайне важно разработать методы с высоким разрешением для изучения DDR и ремонта процессов в контексте внутреннего ядерного среды в живой клетке для того чтобы понять кратко – и долгосрочной перспективе последствия повреждения ДНК.

Решающую роль НОМИНАЛЬНОЙ полимеразы (ПАРП) в измерении масштабов и тип повреждения и регулировании Ассамблеи белка в месте повреждения
PARP1-сенсор Ник ДНК быстро активированную повреждения ДНК, что играет решающую роль в ДНК ремонт13. PARP1 первоначально считалось функционировать вместе с рентген ремонт крест дополнение 1 (XRCC1) для облегчения ремонта база эксцизии (BER), но последние исследования показывают свою роль в другие ДНК ремонт пути, включая DSB ремонт14. Активирован PARP1 использует Никотинамидадениндинуклеотид (NAD+) как субстрат для ADP-ribosylate несколько целевых белков, включая себя саму. Этот фермент и других членов семьи привлекли большое внимание в последние годы как ингибиторы ПАРП появились как многообещающие лечебных препаратов для рака. Хотя первоначально битор PARP оказались эффективными в ген рака молочной железы (BRCA)-мутировал клеток рака молочной железы, в настоящее время существует множество доказательств для их эффекты в моно – и комбинация терапии вместе с ДНК повреждения агентов/облучения против широкий спектр рака с мутациями, не ограничиваясь BRCA15,16,,1718,19,20.

На молекулярном уровне активации ПАРП было показано играть решающую роль в организации местных хроматина структуры в местах повреждения. PAR-зависит от набора хроматина модификация ферментов способствует DSB ремонт и ремонт диктует выбор пути, предлагая роль важных лесов НОМИНАЛЬНОЙ модификации в местах повреждения. 13,21,,2223,24,25,26,27,28,29, 30,31 мы недавно продемонстрировали исключение белок p53-1 (53BP1) от повреждения сайтов PAR 32, обеспечивая Альтернативное объяснение для 53BP1-зависимых гиперактивацию (не гомологичных endjoining NHEJ), ПАРП ингибитора и подчеркнув значимость ПАРП в ДГЖД ремонт пути выбора33,34. PARP1 также непосредственно ремонт PARylates и влияет на активность нескольких ДНК факторов14.

Использование лазерной Microirradiation как инструмента для изучения DDR/ремонт в естественных условиях
Лазерная microirradiation производить субмикронных изменения отдельных хромосом впервые описано в 1969 году35 и подробно рассматривается в 1981 году36. Несколько десятилетий спустя, лазерная microirradiation было показано, чтобы вызвать повреждение ДНК на определенных субмикронной региона в ядре клетки и было доказано, чтобы быть полезен для изучения набора или изменения различных факторов поражения ДНК в vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. Этот метод позволяет обнаружение тех факторов, которые не образуют собственный облучения индуцированной очагов (IRIF) в ущерб сайтов39,42. Это также возможно для изучения динамики пространственно-временных хроматина структурных изменений как в местах повреждения, так и в остальной части ядра. Мы тщательно сравнить инвентаризацией, вызванных различными лазерных систем и ввода полномочия для оценки взаимосвязи между типом повреждения ДНК и microirradiation условий32,,4344, 45. Аномальным набора моделей 53BP1 и telomeric повторить связывание фактор 2 (TRF2) были замечены в ходе предыдущих исследований ущерб лазера, которые послужили основой для повторяющихся озабоченность для «не физиологические» Природа лазерного разрушения46 ,47,48,49. Мы обнаружили, что эти очевидных расхождений теперь может быть объяснено дифференциального ПАРП сигнализации, который измеряет количество и сложность индуцированных повреждений32. Мы подтвердили, что: 1) лазер microirradiated клетки (даже после высокой входной мощности облучения) арестованы в интерфазе образом ущерб контрольно-пропускной пункт управления зависимых и оставаться жизнеспособными (по крайней мере до 48 ч)32,50; и 2) ремонт фактор вербовки/модификации добросовестно повторить те с лечения с обычными ДНК повреждения агентов и DSB индукции под наблюдением эндонуклеазами32,,3942, 44,50,,5152. Эти результаты решительно поддерживают физиологические актуальность изучения лазерной повреждения индуцированных клеточных реакций.

Protocol

1. Подготовка основные клетки Примечание: Этот шаг является для обнаружения стандартных иммунофлюоресценции эндогенного белка вербовки или модификации и для использования клеточной линии, стабильно выражая дневно тегами рекомбинантных белков. К примеру, Potorustridactylus …

Representative Results

С помощью PtK2 клетки, стабильно выражая1220-1711 EGFP-53BP1 или TRF2-рекламы ЯФП, титрование входной мощности лазера была проведена определить оптимальные условия для их найма (рис. 1)32. На высокий входной мощности лазерного ущерб сайтов наблюдалис?…

Discussion

Преимущества использования лазерной microirradiation для DDR исследований являются:

1. целесообразно побудить различные типы и количество ДНК повреждения от простых стренги перерывы сложные повреждения ДНК, и обнаружить ремонт различных факторов в ДНК повреждения сайты, регули?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим д-р Акира Ясуи в Университете Тохоку, Япония для плазмида GFP-NTH1 выражение и доктор Eros Lazzerini Denchi на Scripps научно-исследовательский институт, Ла-Хойя, Калифорния TRF2-рекламы ЯФП и EGFP-53BP11220-1711 выражение плазмид. Эта работа была поддержана военно-воздушных сил управлением научных исследований (FA9550-04-1-0101) и Институт лазерной Бекман Inc. Фонд (для M.W.B), Стипендия Фонда Форда в национальной академии наук (до B.A.S) и NSF MCB-1615701 и CRCC КАБ-17-426665 (для к. Г.).

Materials

Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread–chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R., Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed?. Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A., Piccart, M. An update on PARP inhibitors–moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O’Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Tags

Laser MicroirradiationDNA DamageDNA RepairDNA Repair FactorsCellular ResponseReal-time AnalysisSingle-cell AnalysisFluorescently-tagged Proteins53BP1NTH1Liposome-mediated Transfection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Kong, X., Cruz, G. M., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image