Summary

Integración Derivación Gratuita de Células Madre Pluripotentes Inducidas Humanas Usando Laminin 521 Matrix

Published: July 07, 2017
doi:

Summary

derivación robusta de las células inducido por el hombre pluripotentes madre (HIPS) se logró mediante el uso de no-integración de virus Sendai (SeV) vector reprogramación mediada de fibroblastos dérmicos. el mantenimiento de células caderas y la expansión clonal se realizó utilizando condiciones de cultivo libre de xeno y definidos químicamente con laminina humana recombinante 521 (LN-521) de matriz y esencial E8 (E8) Medium.

Abstract

Las condiciones sin Xeno y completamente definidas son parámetros clave para la generación robusta y reproducible de células de vástago pluripotentes inducidas por humanos (HiPS) homogéneas. El mantenimiento de células hiPS en células alimentadoras o matrices indefinidas son susceptibles a variaciones en lotes, contaminación patógena y riesgo de inmunogenicidad. La utilización de la matriz de laminina 521 (LN-521) humana recombinante definida en combinación con formulaciones de medios sin xeno y definidas reduce la variabilidad y permite la generación consistente de células hiPS. El virus Sendai (SeV) vector es un no-integrar RNA-basado en el sistema, evitando así las preocupaciones asociadas con el potencial efecto disruptivo sobre la integridad del genoma integrar vectores pueden tener. Además, estos vectores han demostrado una eficacia relativamente alta en la reprogramación de fibroblastos dérmicos. Además, el paso enzimático de celdas individuales facilita el mantenimiento homogéneo de las células HiPS sin experiencia previaLl cultura. Aquí se describe un protocolo que ha sido ampliamente probado y desarrollado con un enfoque en la reproducibilidad y facilidad de uso, proporcionando una manera robusta y práctica para generar definido y xeno-libre humanos hiPS células de fibroblastos.

Introduction

Desde la primera derivación de las líneas de células HiPS por Takahashi et al. 1 , 2 , HiPS células han proporcionado una herramienta útil para la enfermedad de modelado, descubrimiento de fármacos y como material de origen para la generación de terapias celulares en la medicina regenerativa [ 3] . El cultivo de células hiPS ha dependido durante mucho tiempo del co-cultivo con células alimentadoras de fibroblastos 4 , 5 o en Matrigel 6 y con formulaciones de medios que contienen suero fetal bovino (FBS). Las variaciones de lote a lote son una consecuencia común de la naturaleza indefinida de estas condiciones de cultivo, lo que resulta en variaciones impredecibles, lo que es un contribuyente importante a la falta de fiabilidad de estos protocolos 7 . El desarrollo de un medio definido tal como Essential 8 (E8) 8 y matrices de cultivo celular definidas por ejemplo LN-521 9 , permitenS para el establecimiento de protocolos altamente reproducibles y ayuda en la robusta generación y mantenimiento de células hoPS homogéneas 7 , 8 , 9 , 10 .

El desarrollo de técnicas de reprogramación libres de integración ha sido un salto adelante. Originalmente, la reprogramación dependía de los vectores retrovirales que se integraron al azar en el genoma con efectos perjudiciales sobre la integridad genómica [ 11] . Los avances en las metodologías de reprogramación incluyen el desarrollo de vectores basados ​​en ARN. Los vectores de ARN tienen una ventaja sobre el método de reprogramación basado en el ADN como la integración no intencional a través de la recombinación genómica no es posible [ 12] . Los vectores SeV proporcionan una expresión alta y transitoria de factores exógenos a través de ARN monocatenario sin una fase de ADN 11 . Los vectores de reprogramación entregados por el SeVSe diluyen a lo largo de la expansión celular y eventualmente se desprenden del cultivo proporcionando una forma libre de reprogramación. Posteriormente, el mantenimiento de la pluripotencia depende de la expresión endógena de los genes de pluripotencia [ 2] .

Como las terapias pioneras basadas en células de HiPS están comenzando a entrar en ensayos clínicos, las demandas de lotes estandarizados, reproducibilidad y seguridad son cuestiones esenciales para abordar. Por lo tanto, deben evitarse los productos de origen animal. Por ejemplo, el uso de productos xenogénicos se ha asociado con el riesgo de contaminación no humana de patógenos. Además, se ha demostrado que las células cultivadas en presencia de componentes de cultivo derivados de animales incorporan ácidos siliacos no humanos en las membranas celulares, lo que amenaza con hacer que las células derivadas sean inmunogénicas 14 . Por lo tanto, la necesidad de eliminar los productos xenogénicos es necesaria para cualquier actividad clínica futura. Este protocolo se aplica xeNo-libre y definido en el mantenimiento de las células HiPS celdas móviles más cerca de cumplimiento clínico.

Este protocolo describe un método consistente, altamente reproducible y fácil de usar que genera células hiPS estandarizadas a partir de fibroblastos. También ofrece un sistema de cultivo de fácil manejo para el mantenimiento de las células hiPS establecidas. Este protocolo se ha utilizado para derivar más de 300 líneas celulares hiPS en la instalación nacional sueca de iPS core humano en el Instituto Karolinska, de la cual algunas líneas se han descrito previamente 15 , 16 .

Protocol

La recopilación de material para pacientes y la derivación de las células del hiPS es aprobada por la Junta de Revisión de Ética, Estocolmo, 28 de marzo de 2012, Número de registro: 2012 / 208-31 / 3. Los pasos de cultivo celular deben realizarse en los gabinetes de seguridad de la biotecnología a menos que se indique lo contrario. Siempre practique técnicas de manejo estériles cuando trabaje con células. Deje que los medios, placas y reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de comenzar. Incubar las c?…

Representative Results

De la biopsia a las células HiPS Todo el proceso desde la biopsia hasta las células hiPS establecidas, desprotegido del vector de reprogramación y listo para su caracterización, toma aproximadamente 16 semanas ( Figura 1 ). En la Figura 2A se especifica un cronograma más detallado. Se necesitan aproximadamente 4 semanas para establecer y expandir los cultivos de fib…

Discussion

El resultado esperado de este protocolo es la generación exitosa de varias líneas celulares de hiPS derivadas clonalmente. Es importante destacar que el método para el mantenimiento y la expansión de las células hiPS establecidas aquí descritas es fiable y puede realizarse con poca experiencia previa de cultivo de células madre. Se sabe que el paso de células únicas enzimáticas con ROCKi junto con la matriz LN-521 mantiene las células como cariotipicamente normales, pluripotentes y fácilmente capaces de dife…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por los agentes de financiación SSF (B13-0074) y VINNOVA (2016-04134).

Materials

Dispase Life Technologies 171105-041 Biopsy digestion
Collagenase Sigma C0130 Biopsy digestion
Gelatin Sigma G1393 Fibroblast matrix
IMDM Life Technologies 21980002-032 Fibroblast medium
FBS Invitrogen 10270106 Fibroblast medium
PenicillinStreptomycin Life Technologies 15070-063 Antibiotic
Essential 8 media ThermFisher Scientific A1517001 iPS cell culture media
LN-521 Biolamina LN521-03 iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X ThermoFisher Scientific 12563011 Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632 Millipore SCM075 Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit Life Technologies A1377801 Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900.300 Cell culture
60 mm tissue culture dishes Sarstedt 83.3901.300 Cell culture
24 well tissue culture plates Sarstedt 83.3922.300 Cell culture
T25 tissue culture flasks VWR 734-2311 Cell culture
15 ml tubes Corning 430791 Centrifuge tubes
1.5 ml tube Eppendorf 0030123.301 1.5 ml tube
CoolCell cell LX Biocision BCS-405 Freezing container
DMSO Sigma D2650-100ml Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 ml VWR 479-6847 Cryovials
PSC Cryopreservation Kit Gibco A2644601 PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisherScientific 25300054 Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12 Life Technologies 31331-028 Digestive enzymes dilutant
DPBS Life Technologies 14190-094 PBS
HBSS ThermoFIsher Scientific 14025-050 Biopsy preparation
Haemocytometer Sigma BRAND, 718920 Cell counting

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
  3. Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  5. Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
  6. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  7. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
  8. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
  9. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  10. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
  11. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  12. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  13. Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
  14. Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
  15. Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
  16. Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
  17. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009)
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  19. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  20. Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
  21. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
  22. . Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016)
  23. Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).

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Citer Cet Article
Uhlin, E., Marin Navarro, A., Rönnholm, H., Day, K., Kele, M., Falk, A. Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix. J. Vis. Exp. (125), e56146, doi:10.3791/56146 (2017).

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